GFP转基因骨髓间充质干细胞的定向诱导分化及脑内移植的实验研究

摘要

帕金森病是老年人常见的神经退行性疾病,其病理学基础为中脑黑质向纹状体投射的多巴胺能神经元进行性退变,造成脑内多巴胺含量减少,从而引起震颤、肌张力增高及运动障碍等一系列临床表现。目前多采用药物治疗,但不能根治该病的发展。
　　 细胞移植治疗帕金森病的实验研究已开展多年,有的采用胚胎中脑细胞或肾上腺髓质细胞移植,虽有一定的疗效,但不持久,因为是细胞存活时间不长。而干细胞移植可针对性地补充退变的多巴胺能神经元,是治疗帕金森病的理想方法,但一直难以找到合适的细胞来源。近年来发现神经干细胞可以增殖并分化为多巴胺能神经元,是理论上合适的供体细胞,但是胚胎神经干细胞的取材存在伦理学上的问题,成体神经干细胞含量少且不易取材,这些都限制了神经干细胞在治疗神经退行性病变中的应用。
　　 骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞,可以分化为三个胚层来源的细胞,在特定诱导条件下,BMSCs可分化为神经细胞,尤其是分化为多巴胺能神经元,用于移植治疗帕金森病可避免法律和伦理学上的麻烦,这些优点使得BMSCs成为细胞移植的新的供体来源。但是目前尚无有效方法将BMSCs诱导分化为多巴胺能神经元。
　　 纹状体是中脑黑质多巴胺能神经元投射的靶组织,在胚胎发育过程中,中脑神经元轴突逐渐投射到纹状体,在纹状体组织微环境的诱导下,这些神经元分化为功能明确的多巴胺能神经元。研究表明,纹状体内含有多种神经营养因子和神经诱导因子,对中脑多巴胺能神经元的生长和发育起重要作用。本实验室曾经用纹状体提取液或纹状体组织块将胚胎干细胞及神经干细胞成功诱导分化为多巴胺能神经元。鉴于上述思考,本研究设计以下实验检测纹状体组织微环境对BMSCs的定向诱导分化作用。在体外实验中,制备了纹状体提取液检测其对BMSCs的诱导作用；在体内实验中,将BMSCs移植到脑纹状体内,观察在体纹状体组织微环境对BMSCs的定向诱导分化作用。
　　 众所周知,普通的BMSCs移植到鼠脑后,由于无法区分供体细胞和受体组织而难以准确检测到BMSCs的分化及分布情况。为了识别移植细胞,在以往的移植实验中多采用二苯甲酰胺(Bis benzamide,BBZ)或5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)来标记细胞。但研究表明BBZ和Brdu可能会扩散进入供体细胞,且随着细胞分裂标记物会逐渐稀释,难以准确示踪。为了准确示踪及分析BMSCs的体内存活和分化情况,我们从GFP(green fluorescentprotein)转基因鼠取材了BMSCs,即GFP-BMSCs。GFP转基因鼠来源的BMSCs的GFP基因会随着细胞分裂、增殖传递到子代细胞中,在细胞中稳定表达,且终生存在。标记细胞在荧光显微镜下可直接检测到,易于追踪移植BMSCs在脑内的存活、分化与迁移情况。
　　 本实验用取自GFP转基因鼠的BMSCs,进行了体内和体外定向诱导分化的实验研究。在体外实验中,采用全骨髓细胞接种贴壁培养法培养GFP-BMSCs,并应用流式细胞术检测传代细胞CD29、CD11b的表达情况进行细胞鉴定:制备纹状体提取液,将纹状体提取液加入GFP-BMSCs的培养基中作为实验组,观察细胞生长及分化情况,正常培养的GFP-BMSCs作为对照组。应用流式细胞术检测纹状体提取液对GFP-BMSCs的细胞周期的影响,行免疫细胞化学染色技术检测GFP-BMSCs表达神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及酪氨酸羟化酶(tyrosinehydmxylase,TH)的情况,以检测其分化状况。
　　 在体内实验中,将GFP-BMSCs通过立体定位仪植入大鼠脑纹状体,分别在移植术后的1d、7d、14d、28d及45d灌注取脑,经过固定沉糖后做冰冻切片,观察GFP-BMSCs在脑内的存活与分布情况,并采用免疫组织化学染色技术检测移植细胞分化为神经元、神经胶质细胞及多巴胺能神经元的情况。
　　 结果显示,体外培养的GFP-BMSCs在荧光显微镜下呈现绿色,传代培养的细胞呈现均一的长梭形并排列成梳状、细胞密集处呈现旋涡状或团状等骨髓间充质干细胞典型的形态特征。流式细胞术显示取材的细胞表达CD29,而基本不表达CD11b,显示细胞纯度较高。细胞生长曲线显示第3代BMSCs具有良好的增殖能力。加入纹状体提取液后细胞生长良好,部分细胞长出突起,呈现神经细胞样。流式细胞术分析显示纹状体提取液可促进GFP-BMSCs从G0／G1期向S期转化,即促进细胞DNA复制和蛋白质的合成。免疫细胞化学染色结果显示,实验组培养细胞可检测到NSE、GFAP及‘TH的表达,其中NSE阳性率为37.00±4.29％,GFAP阳性率为14.56±2.49％,TH阳性率为15.00±3.83％；对照组细胞NSE阳性率为2.30±0.77％,未检测到GFAP和TH的表达。实验组与对照组结果比较具有统计学意义(三种染色结果分析均p<0.01.),即纹状体提取液能诱导GFP-BMSCs向神经细胞方向分化,尤其是多巴胺能神经元。
　　 体内实验结果显示,GFP-BMSCs移植到脑纹状体后存活良好,可观察到明显的移植区。随着移植时间的延长,部分GFP-BMSCs从移植区迁移至纹状体,并分化为NSE、GFAP和TH阳性细胞,表明移植细胞可分化为神经元及神经胶质细胞并能在纹状体内分化为多巴胺能神经元。细胞移植后大部分分布于纹状体,也有少量的移植细胞可见于皮层、侧脑室和胼胝体等处。
　　 综上所述,实验结果表明,从GFP转基因鼠获取的BMSCs能够在纹状体提取液和体内纹状体微环境的诱导下定向分化为多巴胺能神经元。