低分子肝素分子量测定用对照品的研制

摘要

低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）是肝素经化学或肝素酶降解或物理分级方法制备而成的肝素片段或组分，其平均分子量在8000以下，小于8000的组分不少于60％，抗FXa活性不低于70IU/mg，抗FXa/抗FⅡa不小于1.5。LMWH与肝素钠主体结构一致，是由艾杜糖醛酸或葡糖醛酸与氨基葡糖以及它们的硫酸化和乙酰化衍生物组成的多糖链混合物为双糖单位，以(1→4)糖苷键连接而成。近30年来临床实践证明，LMWH是优良的抗凝抗血栓药物，与肝素钠相比抗血栓活性相当，但安全性更高。
　　 我国是世界肝素第一生产大国，但目前的状况是80％以上的肝素产量以原料药形式出口，出口的肝素原料药经加工后变成价格更高的LMWH制剂返销回国。我国虽然已有十余个厂家生产LMWH制剂，但国内LMWH质量标准与国外相比明显较低，主要满足低分子肝素定义中分子量及活性的要求，未按工艺进行分类，而不同工艺制备的LMWH有不同的末端结构，不同的工艺相关杂质，不同的平均分子量及分布，这些都影响低分子肝素的活性及体内过程。因此，参照国外标准，并结合国情，尽快提高国内LMWH质量标准十分必要。分子量及分布是LMWH质量标准的的一个重要指标。目前，还没有国产LMWH分子量测定用对照品，只有欧洲药典（European Pharmacopoeia,EP）LMWH分子量测定用对照品，WHO LMWH分子量测定用对照品(International Reference Preparation LMWH for molecular weight calibration)和美国药典(United States Pharmacopoeia,USP)依诺肝素钠分子量测定用对照品。本课题致力于研制国产LMWH分子量对照品，研制了系列窄分布的LMWH分子量对照品和附带一宽分布标样表的宽分布的LMWH分子量对照品，并将两种对照品分别与WHO和USP对照品的测定结果进行了对比。
　　 本研究取得的结果和结论有以下几个方面：
　　 1本课题研制了系列窄分布的LMWH分子量测定用对照品
　　 系列自制窄分布LMWH分子量对照品Mp分别为：1400，1850，2328，2863，5714，7768，10443。7个自制窄分布分子量对照品与USP依诺肝素钠分子量对照品的校正曲线基本重合在一起，分别用自制窄分布对照品和USP依诺肝素钠分子量对照品测定2个不同批次的依诺肝素钠、USP依诺肝素钠分子量系统适用性对照品以及EPLMWH分子量对照品的分子量，结果表明两种对照品测定各样品的Mw相差不大于50，证明制备的系列窄分布样品可以作为LMWH的分子量测定用对照品。
　　 分子量在6000以下的5个窄分布LMWH分子量测定用对照品(1400，1850，2328，2863，5714)的制备方法是以依诺肝素钠为原料，经Biogel P10分离得到。Biogel P10分离依诺肝素钠可见小分子量部分有锯齿状的峰，分别收集相应的峰即可得到6000以下窄分布的系列对照品。
　　 6000以上的2个窄分布LMWH分子量测定用对照品(7768，10443)是以自制的（化学β消除方法）MMWH(Mp8929)为原料，经Biogel P10二次分离得到。本课题还尝试了以SuperdexG75、SephadexG75、UltragelACA44为层析介质分离肝素钠，Sephadex G75为层析介质分离55％分级醇沉的肝素钠样品和超滤分离在10kDa和5kDa间的组分，结果发现无论选择何种原料和层析介质都无法得到类似分离依诺肝素钠的锯齿状峰，且用以上方法得到的样品产率和RI响应值都较低。最后选择产率及RI相应值较高的MMWH为原料，经Biogel P10二次分离后的组分作为7000～11100窄分布LMWH分子量对照品。该法制得的对照品与USP依诺肝素钠窄分布分子量对照品比较峰仍较宽，采用SAX-HPLC和IPRP-HPLC进一步分离自制7000～11100的窄分布LMWH分子量对照品，期望可以得到成分更单一的组分。结果，SAX-HPLC和IPRP-HPLC可以将依诺肝素钠小分子量的组分进一步分离成更单一的组分，但无法对分子量在7000～11100的组分进一步分离。
　　 2研制了附带一宽分布标样表的宽分布LMWH分子量对照品．
　　 利用肝素钠酶Ⅰ降解肝素钠得到宽分布LMWH作为宽分布LMWH分子量对照品，附带的宽分布标样表是由分子量从600～18000的18个分子量与相应的累积百分面积组成，根据宽分布标样表18个点的累积百分面积确定对应宽分布对照品的保留时间，将保留时间与表中对应分子量的对数值进行3次曲线方程拟合，得到校正曲线并进行分子量计算。自制宽分布分子量对照品与WHO分子量对照品UV和RI图谱相似，两种对照品得到的校正曲线几乎重合在一起。用WHO LMWH分子量对照品和自制的宽分布分子量对照品分别测定7种LMWH肝素钠分子量，两者的测定结果不大50，说明制备的样品可以作为宽分布LMWH分子量对照品测定各LMWH分子量。
　　 EPLMWH分子量对照品需要RI和UV联用，专用GPC软件，而本课题制备的两种LMWH分子量对照品只需RI检测器和普通GPC软件，计算方法更简便。本课题成功研制了分子量从1000～11100的系列窄分布LMWH分子量对照品和附带一宽分布标样表的宽分布分子量对照品，为LMWH分子量测定用对照品的国产化奠定了基础。