小麦/长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系新种质的遗传基础研究

摘要

本实验室以普通小麦济南177(JN177)原生质体为受体，经380μw/cm2紫外线照射30s的长穗偃麦草原生质体为供体进行非对称的体细胞杂交，获得了可育杂种植株，从中筛选出一系列高产、耐盐、耐旱、优质的小麦渐渗系新品种和新种质。本实验室前期的SSR分析表明小麦体细胞杂种渐渗系不仅含有长穗偃麦草的遗传物质，而且亲本JN177的DNA序列也发生了较大变异。对亲本济南177/长穗偃麦草和体细胞杂种渐渗系的高/低分子量麦谷蛋白亚基基因家族的克隆和序列比较分析表明，体细胞杂交过程产生了许多亲本小麦济南177所不具有的新的高、低分子量麦谷蛋白亚基基因。体细胞杂种渐渗系中的这些新基因，一部分是长穗偃麦草的基因渐渗进入济南177基因组，或者是济南177原有基因的变异，包括点突变和复制滑动，还有些来自双亲基因的重组。4个优质杂种渐渗系的所有22个麦谷蛋白亚基基因中，两个来源于长穗偃麦草，其它20个均在体细胞杂交过程中发生等位变异。进一步在全基因组水平研究体细胞杂交过程引起的遗传和表观遗传变异及其机制是将体细胞杂交技术应用于小麦作物改良的基础。本研究选择分别具有高产和耐盐新性状的两种渐渗系新品种和新品系山融1号(SR1)及山融3号(SR3)为材料，利用各种分子标记在全基因组水平上对体细胞杂交过程引起的小麦重复序列和基因编码区的DNA序列变异进行分析，探讨这种变异的可能机制。此外还对体细胞杂种渐渗系的基因表达变异进行分析，进而了解渐渗系表型和性状变异的原因，为更好地将体细胞杂交技术及杂种新种质用于育种实践奠定理论基础。另外，探究体细胞杂交引起的基因启动子区和编码区DNA甲基化修饰的变化可以帮助了解体细胞杂种渐渗系基因表达变化的机制，有助于解释杂种渐渗系和亲本济南177间的表型差异，也有助于我们对小麦耐盐机制的理解。
　　 本研究的主要结果如下：
　　 1.非对称体细胞杂交引起的遗传变异分析
　　 利用SSR/AFLP/EST-SSR/IRAP/REMAP技术系统分析体细胞杂种渐渗系SR1、SR3和JN177在重复序列、基因编码区、反转录转座子等的差异，并与多倍体化过程相比较，探讨体细胞杂交引起DNA序列变异的机制。
　　 利用基因组SSR位点分析可以了解杂种基因组简单重复序列的多态性及其产生的原因。通过对两个体细胞杂种渐渗系、JN177及长穗偃麦草基因组116个微卫星位点的研究，我们发现杂种渐渗系含有少量长穗偃麦草的遗传物质。与JN177相比，体细胞杂种渐渗系SR3和SR1在40(34.48％)个位点上发生了变异。两个体细胞杂种渐渗系间在检测的基因组SSR位点上没有出现差异。另外对体细胞杂种渐渗系SR3/SR1 R2和R10代间在SSR位点上的变异进行检测，我们发现体细胞杂种渐渗系早代和晚代间遗传序列保持稳定。
　　 为了研究体细胞杂交引起的基因编码区的简单重复序列(SSR)的变异，并与基因组SSR序列变异相比较，本实验利用根据小麦EST序列设计的SSR引物对体细胞杂种渐渗系的R2代与两个亲本JN177、长穗偃麦草的基因组进行分析。在所有检测的108对引物中，22(20.37％)对引物在SR3与JN177间表现出多态性的带型，比SR3与济南177间基因组SSR序列的差异(34.48％)小得多。同样，R2和R10代间的EST-SSR序列亦保持稳定。
　　 AFLP分析是在全基因组水平上对体细胞杂交引起的变异进行全面分析的技术。通过对杂种后代以及亲本基因组904个位点进行AFLP分析发现在杂种渐渗系SR3中消减的条带总数为28条，新出现的条带总数为20条。非对称体细胞杂交过程中亲本JN177约有3.54％的位点发生变异。
　　 本实验利用IRAP和REMAP技术检测体细胞杂种渐渗系反转录转座子的激活情况。在JN177和杂种渐渗系SR1/SR3中共检测了116个位点，其中10(8.26％)个位点在JN177和山融3号中表现出多态性。通过对部分发生变异的条带进行DNA序列分析，并在Genbank搜索其同源序列以了解变异序列的信息，我们发现反转录转座子的激活可能影响到其位点附近的功能基因。
　　 本研究利用SSCP技术检测体细胞杂交引起的JN177基因序列的变异。结果显示非对称体细胞杂交引起JN177基因组基因序列大片段的插入和删除，并影响对应基因的表达。另外非对称体细胞杂交引起JN177基因组基因序列的点突变也是一个广泛存在的现象。大量新的基因片段的出现是体细胞杂交不同于多倍体化过程的一个显著特点。
　　 以上结果表明：体细胞杂交过程同样引起亲本基因组序列的大规模变异，各种不同的序列组分在体细胞杂交过程中变异的比率有显著的差异。基因组中的易变位点，如SSR序列和反转录转座子序列变异比率分别高达34.4％和8.26％，而基因序列的变异比率(包括基因序列丢失/插入和SNP)为4.17％。各种不同序列所处染色质位置的不同结构可能是各种序列变异比率不同的原因。调控染色质结构的表观修饰机制在这一过程中的作用是个值得进一步的研究的问题。体细胞杂交引起的重复序列、基因编码序列等的变异与常规远缘杂交多倍体化过程都有明显的不同。同样经历了异源基因组造成“冲击”(shock)，体细胞杂交与多倍体化存在显著的差异。此外，体细胞杂交还同时反映了远缘杂交和渐渗过程中的基因组变异的特点，是研究植物远缘杂交中植物基因组应对外源“冲击”(shock)和进化的一个不同于多倍体化的新的体系。
　　 2.非对称体细胞杂交引起的表观修饰变异
　　 包括DNA甲基化修饰在内的表观遗传修饰机制对基因表达调控具有重要的作用。本实验利用MSAP技术检测体细胞杂交引起的基因组水平的胞嘧啶甲基化修饰变异。在对照培养条件下，我们发现渐渗系SR3和亲本济南177相比在84(23.33％)个位点上出现甲基化修饰差异。体细胞杂交中DNA甲基化修饰状态发生变异的位点绝大多数在两个杂种渐渗系中保持一致。这说明体细胞杂交过程中DNA甲基化修饰状态的变异不是随机发生的。对甲基化修饰状态发生变异的位点进行测序比对发现变异序列主要来自反转录转座子。本实验还对盐处理条件下亲本济南177和渐渗系基因组DNA甲基化修饰状态进行分析，发现盐处理仅对基因组DNA甲基化修饰状态有很小的影响。体细胞杂交引起的DNA甲基化修饰变异是渐渗系与亲本济南177间DNA胞嘧啶甲基化修饰状态差异的主要原因。
　　 为了具体了解体细胞杂交引起的DNA胞嘧啶甲基化修饰状态的变化对基因表达的影响，本实验还选择了5个山融3号中已经鉴定功能的耐盐相关基因和启动子序列进行重亚硫酸盐测序，在碱基水平上精细分析基因序列中胞嘧啶甲基化修饰状态的变异，以及这种变异对基因表达的影响。本实验发现小麦基因启动子区域被甲基化修饰的比例较高，基因表达与启动子区域胞嘧啶甲基化修饰水平呈负相关。本实验检测的3个小麦基因编码区中，仅有1个基因编码区被甲基化修饰。体细胞杂交引起了SR3与JN77基因启动子区域广泛的胞嘧啶甲基化修饰变异，变异的比率根据基因的不同有所不同，从最低0.00％(TαWRKY1-7)到最高25.00％(TαCHP)，平均变异比率为12.26％。我们发现非对称体细胞杂交引起的基因启动子序列胞嘧啶甲基化修饰程度变异对杂种渐渗系中对应基因的表达有重要的影响。但是除TαFLS2基因外，启动子区域胞嘧啶甲基化修饰变异趋势与基因芯片检测对应基因的表达变异情况并不完全对应。DNA甲基化修饰与激活或抑制基因表达的各种组蛋白修饰协调作用，共同形成调控基因表达的严密而灵敏的机制。DNA甲基化修饰作为表观修饰机制的一种，与基因表达量不能完全对应是正常的。我们还需要进一步研究体细胞杂交引起的其它表观遗传变异，综合理解体细胞杂种渐渗系中基因表达变异的机制。
　　 我们认为非对称体细胞杂交过程中，在细胞核中共存的长穗偃麦草和济南177的基因组包括同源序列和非同源序列间存在着复杂的相互作用，引起各种遗传和表观遗传变异。遗传和表观遗传变异之间并不是相互独立的。DNA胞嘧啶去甲基化引起反转录转座子的激活，同源序列间的相互作用可能引起基因沉默等。各种遗传和表观遗传变异结合起来，共同促进了体细胞杂种渐渗系优良表型的出现。
　　 3.非对称体细胞杂交引起的基因表达变异
　　 本实验利用SSCP技术分析了JN177和体细胞杂种渐渗系SR1/SR3在盐处理和对照培养条件下根和叶的基因表达情况。在检测的80对引物中，我们发现对照培养条件下有6(7.5％)对引物在渐渗系中发生了一个同源基因表达被抑制的情况。此外我们还发现了三例(3.75％)某一同源基因在渐渗系中被激活的现象。在SSCP分析中没有发现体细胞杂种渐渗系SR1/SR3间基因组DNA序列的差异。但是在叶的mRNA分析中我们发现两例(2.5％)SR1/SR3间基因表达差异的情况，而且SR1/SR3问基因表达差异具有器官特异性。这很可能是由于两个渐渗系间基因表达调控的差异引起的。渐渗系中基因表达的激活或沉默部分是由DNA序列的变异、基因表达调控网络和表观修饰的变化引起的。我们发现在渐渗系中酪蛋白激酶CK2和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因被激活。这两个基因的激活对渐渗系的表型差异可能有重要的影响。
　　 本实验利用SSR/EST-SSR/AFLP/IRAP/REMAP/SSCP等多种分子标记技术对亲本济南177和两个具有优良表型的体细胞杂种渐渗系新材料SR1和SR3间的遗传、表观遗传和基因表达变异进行系统的研究。通过本论文的研究发现，非对称体细胞杂交过程引起了济南177基因组遗传、表观遗传水平的广泛变异。SSR序列和反转录转座子的变异对济南177的基因序列产生了影响。同源重组和非同源末端连接(NHEJ)等DNA修复方式也造成了基因编码序列的变异。表观修饰的变异对渐渗系的基因表达水平产生影响。遗传和表观遗传水平的各种变异综合起来促进了渐渗系表型的改善。非对称体细胞杂交过程引起的遗传和表观遗传变异与远缘杂交和多倍体化过程有相似的地方，也有自己独特的特点。因此体细胞杂种渐渗系是研究植物基因组进化的一个全新的体系。