血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中抑癌基因PTEN的影响及分子机制研究

摘要

血管平滑肌细胞(vascular smoooth muscle cell，VSMC)位于动脉血管中膜，是血管中层唯一的细胞成分。VSMC的异常增殖，导致其由中膜迁移到内膜下间隙，是冠状动脉硬化、经皮穿刺腔内冠状动脉成形术再狭窄以及高血压血管肥厚等疾病的病理基础。因此找到VSMC异常增殖的机制，抑制VSMC异常增殖是治疗这些血管肥厚性疾病的重要途径。
　　 人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是近年来发现的一种新的抑癌基因，是具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制因子，在中枢神经系统、心脏、肝脏、肾脏、胃肠道、肺脏及皮肤等全身多器官均有表达，且参与多种生理过程，尤其是对肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡、粘附和迁移均具有重要影响。近年来，对PTEN的研究逐渐从肿瘤领域延伸到其他领域中，随着研究的深入人们发现PTEN在心肌肥大，高血压，动脉粥样硬化，支气管哮喘哮等疾病中也发挥重要的作用。本课题应用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移，从细胞和分子水平深入探讨AngⅡ是否影响平滑肌细胞中抑癌基因PTEN的活性和表达以及其下游信号通路，发挥促血管平滑肌细胞异常增生和迁移的作用。并且初步探讨血管平滑肌细胞增殖中PTEN的表达如何被调控。
　　 一、血管紧张素Ⅱ促进平滑肌细胞增殖和迁移，抑制凋亡
　　 应用MTT法，CCK-8法及划痕实验，证实AngⅡ可以促进平滑肌细胞的增殖与迁移，并且确定了AngⅡ的最佳浓度和作用时间。经MTT法检测细胞活力，发现1μmol/L以及10μmol/L两个浓度的AngⅡ作用12小时和24小时后均能显著促进平滑肌细胞增殖，而0.1μmol/L AngⅡ作用不及另两个浓度。1μmol/L AngⅡ增殖促进率为12小时13.6％(p＜0.001)，24小时13.9(p＜0.01)，作用稳定。再经CCK-8法确证1μmol/L的AngⅡ在24小时内呈时间依赖性的促进平滑肌细胞增殖，12小时和24小时对平滑肌细胞增殖的促进率分别为10.4％(p＜0.01)和9.8％(p＜0.05)。划痕实验的结果显示，1μmol/L的AngⅡ在12小时内呈时间依赖性的促进平滑肌细胞迁移，12小时后AngⅡ组平滑肌细胞迁移的距离约为正常组的1.7倍(p＜0.05)。在检测AngⅡ影响细胞活力的同时，应用免疫印记法检测了细胞中caspase-3的表达，来反映细胞凋亡水平。结果显示，12小时内1μmol/L的AngⅡ可使平滑肌细胞中Caspase-3蛋白的表达呈时间依赖性的减少，降低细胞的凋亡水平。
　　 二、血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞中PTEN及其通路的影响
　　 实验应用western blot检测法及非还原电泳法检测AngⅡ刺激细胞后，PTEN，phospho-PTEN(p-PTEN),reduced-PTEN(re-PTEN),oxidized-PTEN(ox-PTEN)及PTEN下游通路蛋白phospho-Akt(p-Akt)和phospho-FAK(p-FAK)表达的变化。同时应用Realtime-PCR法检测PTENmRNA水平的变化。此外，应用还原型二氯荧光素(2′，7′-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的变化，考察自由基水平与re-PTEN和ox-PTEN表达的关系。结果显示，0.1μmol/L，1μmol/L以及10μmol/L的AngⅡ分别作用于血管平滑肌细胞24h时，细胞内PTEN蛋白的表达水平呈浓度依赖性降低。选用1μmol/L的AngⅡ作用于平滑肌细胞0-12h，PTEN的表达呈现时间依赖性的降低，12h时，其表达降低至正常对照组的1/4(p＜0.001)。RT-PCR的检测结果显示1μmol/L AngⅡ刺激细胞2h后PTENmRNA水平已降低至对照组的1/2(p＜0.01)。说明AngⅡ可以从基因和蛋白水平降低PTEN的转录和表达。应用western blot方法检测到，AngⅡ刺激平滑肌细胞5min后可快速却短暂的升高p-PTEN的表达，2小时后趋于正常水平。向细胞内载入DCFH荧光探针，用AngⅡ刺激后不同时间检测到的细胞内荧光强度反映细胞内活性氧水平。结果显示，AngⅡ刺激平滑肌细胞可以快速升高细胞内活性氧的水平，1小时后达到对照组的1.5倍(p＜0.01)，持续升高2小时后逐渐降低，12小时后基本恢复正常氧化还原状态。这与1μmol/L的AngⅡ作用于平滑肌细胞2h，应用非还原电泳检测到的ox-PTEN的表达逐渐升高的结果具有一致性。1μmol/L的AngⅡ使平滑肌细胞内受PTEN负调控的Akt及FAK通路被激活，p-Akt及p-FAK的表达均呈时间依赖性的升高，AngⅡ作用12小时后p-Akt的表达升高至正常对照组的4.5倍(p＜0.001);p-FAK的表达升高至正常对照组的3.5倍(p＜0.001)。
　　 三、血管紧张素Ⅱ影响平滑肌细胞内PTEN表达的机制研究
　　 预先用某些信号通路或因子的抑制剂、激动剂对平滑肌细胞进行预处理1小时，再加入1μmol/L的AngⅡ共同作用12小时，应用western blot和CCK-8法考察各种调节剂对细胞内PTEN表达水平的影响及对平滑肌细胞增殖的影响，以此分析AngⅡ影响PTEN表达水平的调控机制。western blot检测结果显示，AngⅡ受体抑制剂洛沙坦(losartan，Losa)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone，Rosi)及细胞核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)抑制剂BAY11-7082可以使PTEN的表达恢复甚至高于正常组PTEN的表达；c-jun氨基末端激酶(c-jun NH2-terminal kinase，JNK)抑制剂SP600125组PTEN的表达较AngⅡ组也略有提高；抗氧化剂α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)组细胞PTEN的表达与AngⅡ组相比无明显变化；而磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)抑制剂LY294002，促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK kinase1/2 or ERK kinase1/2, MEK1/2)抑制剂UO126及p38 MAPK抑制剂SB203580三组细胞PTEN的表达较AngⅡ组有不同程度的减少。细胞经相同的处理后，应用CCK-8法检测各种调节剂均对细胞的生长具有抑制作用。NF-κB抑制剂对细胞的生长抑制作用最为明显，抑制率达50％;PI3K抑制剂，JNK抑制剂及p38MAPK抑制剂对细胞生长的抑制率在20％左右；洛沙坦，罗格列酮及MEK1/2抑制剂对细胞生长的抑制率在10％左右；而α-硫辛酸(α-LA)对细胞生长的抑制率为4.23％，不具有统计学差异。
　　 本课题用AngⅡ作为诱因，证实在血管平滑肌细胞过度增殖和迁移的病理过程中抑癌基因PTEN活性和表达下降，因此受其负调控的下游Akt及FAK通路被激活，促使平滑肌细胞增殖和迁移。洛沙坦，罗格列酮以及NF-κB抑制剂可以逆转AngⅡ引起的PTEN表达的下降。抑癌基因PTEN可能成为治疗血管肥厚性疾病的重要靶点之一，具有深入研究的价值。