人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

摘要

目的：人乳头瘤病毒(HPV)是自然界中广泛存在的一类DNA病毒，在人群中具有很高的感染率。HPV感染参与多种肿瘤的形成，其中包括各种消化道肿瘤。在HPV16感染的细胞中，HPV16 E7蛋白存在持续性表达，E7蛋白与肿瘤抑制蛋白Rb蛋白结合，引起细胞内多种蛋白的异常表达，是引起细胞恶性转化的重要原因之一，被认定是HPV16相关肿瘤特异性抗原，也被广泛地认为是HPV16相关肿瘤免疫治疗的理想靶点之一。目前报道HPV16感染相关的临床诊断主要依靠以PCR为主的分子生物学方法，该方法具有设备条件要求高、监测结果假阳性率高等缺点。免疫组化方法则简便、易行。研制和开发简单有效的快速检测HPV单克隆抗体诊断试剂盒对降低HPV感染性疾病的发病率和病死率均具有重要意义。为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗，特制备HPV16 E7的单克隆抗体。
　　 方法：将构建成的PGEx4T-1-HPV16 E7质粒转化BL21细菌，在IPTG诱导下，稳定表达GST-HPV16 E7融合蛋白。经IPTG诱导后，采用Western Blot进行鉴定，HPV16 E7重组蛋白的相对分子质量约为37kD。利用亲和层析法从表达产物中纯化出目的蛋白。以纯化的GST-HPV16 E7蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠，运用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合，采用ELISA双筛，直至检测所有孔均为E7阳性，而GST阴性为止，扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体。
　　 结果：
　　 1.将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的原核表达载体转化BL21细菌，在IPTG诱导下，能稳定表达GST-HPV16 E7融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量约37kD。
　　 2.将细胞融合后，采用ELISA法双筛，直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止，扩大培养、建株、冻存并制备腹水，腹水产量在3～10ml之间，其效价达10-6。
　　 3.成功制备出HPV16 E7单克隆抗体，可在多种肿瘤组织细胞核中染色。
　　 结论：该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb。本实验通过GST融合蛋白成功制备出针对人乳头瘤病毒HPV16 E7蛋白的特异性单克隆抗体，为今后进一步探索其生物学功能、HPV16 E7的检测及免疫学治疗奠定了基础。