辅助生殖技术中受精障碍的预测及补救

摘要

第一章体外受精-胚胎移植中未受精卵子的预测及补救
　　 目的：受精率低(<30％)或者受精失败是体外受精一胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)中困扰辅助生殖技术工作者的常见问题之一。在目前我国不孕症患者求医问药完全自费的国情下，一旦发生，将会极大的加重患者的经济、心理负担。随着生殖医学的不断发展，短时受精的出现为胚胎学家及早观察卵子是否激活，及早进行补救提供了前提条件。本研究的目的是探讨授精后5h对可能受精失败的卵子行补救性卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的可行性。
　　 方法：2009年1月～12月在山东大学附属省立医院生殖医学中心接受IVF的1050名患者，精卵共培养后3h，轻柔脱去外周颗粒细胞至能清晰观察第二极体，若此时未排出第二极体则在授精后4、5h再次分别观察卵子是否排出第二极体。若截止到授精后5小时卵子已经排出第二极体，则认为卵子已经被激活，是受精的征象。如果同一名患者在授精后5h时少于65％的卵子排出第二极体，则剩余的只有第一极体的卵子接受补救性ICSI。若同一名患者在授精后5h时多于65％的卵子已经排出第二极体，则剩余的只有第一极体的卵子不再接受补救性ICSI。按照有无补救性ICSI将IVF患者分为两组：Ⅰ组：部分接受补救性ICSI，本组又按照有无补救性ICSI将卵子分为两部分，补救性ICSI部分，IVF部分；Ⅱ组：未接受补救性ICSI。201名单纯由于男性重度少、弱精子症接受ICSI治疗的患者作为对照组。所有患者均为第一次接受辅助生殖技术治疗。所有患者均签署知情同意书，本研究经过山东大学附属省立医院伦理委员同意。
　　 结果：①Ⅰ组患者卵子在授精后3、4、5h第二极体排出率均低于Ⅱ组(P<0.05)，Ⅰ组患者原发不孕的比例、不明原因性不孕的比例高于Ⅱ组患者(P<0.05)；②Ⅰ组、Ⅱ组、对照组，受精率、多精受精率、生化妊娠率、临床妊娠率、种植率均无显著性差异(P>0.05)，Ⅰ组补救性ICSI部分卵子与IVF部分卵子的优胚率无显著性差异，但Ⅰ组补救性ICSI部分卵子优胚率低于Ⅱ组和对照组(P<0.05)。
　　 结论：IVF中精卵共培养3h是可行的；授精后5h第二极体的排出可作为卵子激活的征象；受精后5h行补救性ICSI可以获得可观的临床结局，且不会增加多精受精率；低受精率可能更容易出现在原因不明性不孕及原发不孕患者。
　　 第二章两种化学激活方案在卵胞浆内单精子显微注射未受精卵子补救中的应用
　　 目的：卵胞浆内单精子显微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的出现，克服了正常生理过程中精子需要克服的重重障碍，解决了大部分重度少、弱精子症患者的生育问题。然而在实际工作中遇到ICSI也不能解决的问题时，如ICSI受精率低甚至完全受精失败，胚胎学家们应该如何去处理?如何最大可能的挽救患者未受精卵子?本研究的目的是探讨A23187及嘌呤霉素在ICSI后未受精卵子补救中的应用。
　　 方法：(1)2010年8月～2011年8月在山东大学附属省立医院生殖医学中心第一次接受ICSI治疗的患者，ICSI时所用精子形态基本正常，若在D1观察原核时发现受精率<30％，则剩余部分未见原核卵子在ICSI后22小时之内进行激活处理：随机分为2组：(1)5μmol/L钙离子载体A23187中37℃处理5 min，然后转移至10μg/ML嘌呤霉素37℃6％COz中培养4小时；(2)5μmol/L钙离子载体A23187中37℃处理30min，转移至常规培养液中培养。分析激活后受精、胚胎发育情况。(2)若在D1观察原核时发现完全受精失败，则用患者丈夫的精子与科研卵子行ICSI，进行科研验证患者丈夫精子是否存在受精功能缺陷。每份精子至少与3个卵子行ICSI。所有患者均签署知情同意书，本研究经过山东大学附属省立医院伦理委员批准。
　　 结果：(1)A23187联合嘌呤霉素组：共有9名患者，共32枚卵子接受激活，激活卵子22枚，2PN为7枚，2-4细胞期胚胎16枚，5-6细胞期胚胎3枚，没有胚胎继续发育到>7细胞；A23187激活30分钟组：共有7名患者，共39枚卵子接受激活，激活卵子34枚，2PN为8枚，2-4细胞期胚胎23枚，5-6细胞期胚胎2枚，>7细胞期胚胎1枚。两组激活率、2PN率、1PN率、卵裂率、2-4细胞期胚胎率、5-6细胞期胚胎率均无统计学差异(P>0.05)(2)共有8名患者接受精子验证试验，没有患者再次发生完全受精失败。
　　 结论：(1)A23187联合嘌呤霉素、A23187两种方法均可以应用于ICSI后未受精卵子的补救处理，从简单、安全的角度可以优先选择A23187激活30分钟；(2)在ICSI时能挑选形态基本正常精子的患者中，ICSI受精率低或者受精失败更主要是由于卵子因素引起。
　　 第三章钙离子载体A23187在ICSI反复受精率低甚至受精失败的高受精风险患者的临床应用价值
　　 目的：尽管卵胞浆内单精子显微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可以解决大多数体外受精中遇到的低受精率或者受精失败，但实际工作中还是会遇到ICSI后受精率低甚至受精完全失败，困扰着临床医生和胚胎学家。如何将实验研究充分的应用于临床工作，更好的为患者服务?本研究的目的是探讨钙离子载体A23187在ICSI反复受精率低甚至受精失败的高受精风险患者的临床应用价值。
　　 方法：(1)2010年8月～2011年8月在山东大学附属省立医院生殖医学中心接受ICSI治疗的患者中，患者病史中至少一个周期ICSI受精率<30％，这部分患者的卵子在ICSI注射后30分钟，随机分为两组：A23187组：随机选取1/2～2/3的卵子接受5μm/L A23187处理5分钟，然后转移至常规受精培养液中进行培养；对照组：未接受激活的剩余卵子。分析激活后受精率、优质胚胎率、生化妊娠率、临床妊娠率、种植率，并与对照组进行比较分析。所有患者均签署知情同意书，本研究经过山东大学附属省立医院伦理委员同意。(2)将5μmol/L设为标准浓度，分别采用1×、2×倍、4×倍标准浓度A23187及1.6％DMSO分别处理卵裂期斑马鱼受精卵(受精后0小时，0hpf)5分钟，之后转移至标准水中培养。对照组：标准水培养斑马鱼卵。每组设4个平行组，每组鱼卵5个。分别观察处理后3、6、10、16、24、32、48、72小时各组胚胎发育、及幼鱼孵出、死亡情况。
　　 结果：(1)共有11位患者，共66个卵子接受激活处理，激活的卵子数45个，2PN39个，优质胚胎18个(46.15％)，移植患者7名，放弃移植4名，共移植15枚胚胎，生化妊娠6名(85.71％)，临床妊娠5名(71.43％)，一名患者为双胎，种植率40.00％。剩余19枚有培养囊胚价值的胚胎进行囊胚培养，共冷冻囊胚5枚。对照组卵子共48个，受精卵子17个(35.42％)，2PN4个，其余13个均为未见到原核但有卵裂，17枚胚胎均停滞在2-4细胞期，且胚胎质量较差。对照组各项指标均显著低于A23187组，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)除4×组的鱼卵在处理后3小时开始胚盘开始发生死亡外，其余各组鱼卵均全部存活且孵出，孵出的幼鱼在形态上与对照组均无显著性差异。1×、2×组斑马鱼卵的胚胎发育自3小时开始发育减缓，发育进程比对照组慢1小时左右，直至30小时时与对照组胚胎发育进程开始保持一致。DMSO组鱼卵发育、孵出均同对照组无显著性差异。
　　 结论：(1)ICSI后30分钟5μm/L A23187处理5分钟可应用于反复受精率低甚至受精失败等高受精风险患者，且可获得可观的临床结局。(2)A23187可能影响到斑马鱼胚胎的外包运动，但在一定的剂量下，仍然可以保证胚胎的正常发育。
　　 第四章 钙离子载体A23187在全部严重畸形精子患者的应用
　　 目的：精子有多种畸形，如头部、颈部、体部畸形等。其中严重的畸形如圆头精子、巨头精子、针头精子等其受精能力会明显降低，即便采用卵胞浆内单精子显微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，全世界范围内报道的受精率也在0～20％之间。如果发生将严重加重患者的精神、经济负担。本研究的目的是探讨A23187在全部严重畸形精子患者的临床应用价值。
　　 方法：2010年8月～2011年8月在山东大学附属省立医院生殖医学中心接受ICSI治疗的患者中，丈夫既往精液常规分析显示：精子畸形率100％。取卵日丈夫所留取的精液常规分析亦显示：精子畸形率100％。行ICSI注射时，尽可能挑选形态相对正常的精子进行注射，但所用精子均为严重畸形精子。这部分患者的卵子在ICSI注射后30分钟，随机将卵子分为两组：A23187组：采用5μm/LA23187处理5分钟，然后转移至常规受精培养液中进行培养；对照组：剩余的卵子。分析激活后受精率、优质胚胎率、生化妊娠率、临床妊娠率、种植率，并与对照组进行比较分析。所有患者均签署知情同意书，本研究经过山东大学附属省立医院伦理委员批准。
　　 结果：共有2名患者，一名患者全部是圆头精子，获卵4个，2个卵子接受激活处理，激活后1个卵子受精，为双原核，D2优质胚胎1枚，没有激活处理的2个卵子没有受精迹象，该患者移植胚胎1枚，获得临床妊娠；另一名患者精子全部为针头精子，获卵4个，2个卵子接受激活处理，所有卵子均未受精，放弃移植。
　　 结论：ICSI后30分钟5μm/L A23187处理5分钟可应用于圆头精子患者，可以获得临床妊娠，对于其他严重的头部畸形，A23187的应用还需进一步证实。