JIP3介导TrkB受体顺轴突转运及增强BDNF引发的信号通路激活的功能研究

摘要

研究背景
　　 神经元作为一种高度极化的细胞，通常由胞体、一条轴突和若干条树突组成，通过这些轴突和树突来与周围细胞发生联系；因此各种蛋白分子在神经元突起中的精确定位对于神经元的功能是非常重要的。目前已知，蛋白分子在神经元轴突和树突中的长距离顺向转运(由胞体向远端)主要是由沿着微管运行的分子马达kinesin介导的。其中，在神经元中起到多种功能的运载体的亚型是传统型kinesin(kinesin-1)，它是由两条重链(kinesin heavy chain，KHC)和两条轻链(kinesin lightchain，KLC)组成。目前发现的能够与kinesin-1结合的许多种可溶性的衔接蛋白通过与kinesin-1结合从而介导一些膜结合运载物来通过kinesin-1沿着微管运动。但是，目前尚不清楚在神经元当中哪些运载蛋白是通过kinesin-1来转运的。
　　 神经营养因子(Neurotrophins，NTS)是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质，其成员包括神经生长因子(NGF)，脑源性生长因子(BDNF)，神经营养因子3(NT-3)，神经营养因子4(NT-4)等，在神经元的存活、分化、神经突起的形成以及调节神经环路的功能中起到重要的作用。尤其是脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)在活性依赖的突触功能的变化中起到极为关键的作用。靶组织中分泌的BDNF与位于神经元轴突末梢的TrkB受体结合后可激活受体进行逆向信号转导。因此，神经元中的TrkB受体在细胞体内正确的合成、转运以及定位对于BDNF信号传导至关重要。TrkB受体在神经细胞里沿着轴突和树突顺向转运(从胞体向神经细胞末梢方向)需要由kinesin-1来介导。但是，TrkB受体在神经元轴突和树突中转运机制是否相同目前还尚不清楚。目前已有报道，TrkB受体在神经元中是由Rab27B/Slp1/CRMP-2这个衔接复合体介导与kinesin-1结合从而进行顺向转运的。但是，该实验数据显示，敲除掉这个衔接复合体中的任何蛋白只能使到达轴突末梢的TrkB受体减少30-50％，说明TrkB受体在神经元中的顺向转运还存在有其他的机制。
　　 JNK相互作用蛋白3(JNK-interacting protein3；JIP3)在脑组织中广泛表达，在神经元当中分布于树突、核周体以及神经元轴突。JIP3最初作为一种JNK相互作用蛋白被发现，并且以支架蛋白的方式引发特异的氨基末端激酶信号分子。后续的基因学研究表明，JNK相互作用蛋白3(JIP3)是果蝇Sunday driver以及线虫UNC-16的一种同源体。上述两种都是在依赖kinesin的顺轴突转运中作为衔接蛋白的，作为它们的同源体，JIP3是否也能作为衔接蛋白介导某种蛋白与kinesin结合进行顺轴突转运呢?已有文献报道，JNK3能够与JIP3结合从而沿着轴突进行顺轴突转运，而JIP3能否和其他的运载物直接结合并且介导它们的顺向转运还不清楚。
　　 研究目的:
　　 1.研究TrkB受体顺轴突转运的机制，是否有特异的衔接蛋白介导
　　 2.TrkB受体在神经元轴突和树突中顺向转运的机制是否相同
　　 3.通过对转运机制的调控是否能影响到BDNF引起的后续信号通路，甚至对神经元生理功能产生影响
　　 研究方法:
　　 1.经典坐骨神经结扎实验
　　 坐骨神经结扎实验是一种很成熟的能够从生化水平和免疫组化水平鉴定轴突内转运的分子的体内试验方法，因为坐骨神经组织中富含有长轴突和一部分施旺细胞，对于研究体内的轴突物质转运是很好的方法。成年雄性大鼠麻醉后，将其一侧坐骨神经用5-0线结扎，一天后，取结扎口附近的坐骨神经提取蛋白进行western blot试验检测其中的蛋白的水平，并取对照的未结扎的坐骨神经组织提取蛋白作为对照组，比较其蛋白水平差异，从而进行蛋白转运趋势分析。亦可将结扎口附近组织取材纵向冰冻切片，然后进行免疫组织化学实验分析其中的蛋白转运趋势。
　　 2.免疫荧光分析方法
　　 海马神经元体外培养第5天，用4％多聚甲醛固定10分钟，PBS洗3次后0.4％Triton透化10分钟，再次PBS洗后用10％山羊血清封闭一小时，然后加一抗4摄氏度孵育过夜，PBS洗3次后加荧光二抗，最后PBS洗后加防荧光粹灭剂封片，共聚焦显微镜下观察蛋白的定位情况，并用MetaMorph软件进行荧光定量分析。
　　 3.免疫共沉淀实验分析蛋白蛋白相互作用
　　 HEK293细胞电转染质粒后48小时，用加有合适浓度的蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液充分裂解细胞，裂解液在4摄氏度条件下以14000转/分钟的速度离心15分钟，在可溶性的上清蛋白混合液中加入一抗孵育，4摄氏度2小时以上，然后用结合有细菌蛋白A或者蛋白G的琼脂糖珠子与蛋白复合体充分混合，由于蛋白A或者蛋白G能够特异的与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的FC区结合，所以就能形成相互作用蛋白复合体/抗体/蛋白A或蛋白G/琼脂糖珠子复合体了。经低速离心收集结合了蛋白A或者蛋白G的琼脂糖珠子，用细胞裂解液洗去非特异性结合的蛋白后，就可以进行SDS-PAGE电泳，westernblot蛋白印迹分析相互作用的蛋白了。
　　 为了研究体内蛋白相互作用，取大鼠大脑匀浆，提取蛋白，测浓度后，每个反应管在10mg总蛋白中加入内源性JIP3一抗孵育，用结合有蛋白G的琼脂糖珠子4摄氏度充分结合蛋白复合体，经低速离心收集后可以进行SDS-PAGE电泳，westernblot蛋白印迹，用内源性TrkB、KLC1抗体检测相互作用了。也可以反过来，用内源性KLC1抗体进行一抗孵育，同样步骤，最后用JIP3、TrkB抗体检测相互作用。
　　 4.GST融合蛋白沉降技术
　　 表达TrkB受体JM区的JM1(454-465)；JM2(454-485)；JM3(454-508)；JM(454-537)的cDNA片段被克隆入pGEX-4T-1载体，纯化出带有GST探针的纯化蛋白能够与谷胱甘肽琼脂糖珠结合，His-JIP3-CC1(amino acids451-520)蛋白表达和纯化后与上述结合有GST探针融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠充分孵育，以使蛋白结合。获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胱甘肽洗脱，煮沸，经SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色分析蛋白结合或者用His抗体免疫印迹法分析蛋白结合。
　　 5.活细胞成像技术
　　 用于进行活细胞成像的海马神经元取材后计数用电转仪转染带有荧光的TrkB质粒后在用PDL铺板的玻璃底皿中培养5天，然后将转染细胞放置在尼康TE2000荧光显微镜下用40倍油镜观察，选择具有较健康的形态的神经元细胞进行观察。每一秒拍摄一张荧光照片共拍摄一分钟记录囊泡的运动，用Metamorph软件对囊泡运动进行统计分析。顺向运动，逆向运动，双向运动以及静止不动的囊泡的运动速度被计算出来。每次实验中都要记录和统计至少80到120个囊泡的运动情况，统计求平均值，数据用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，且这些实验结果至少重复3次以上。
　　 6.丝状伪足计数
　　 丝状伪足被定义为神经元上长度小于10微米的小突起，因为我们使用的神经元是培养5天的神经元，树突棘还未长出。丝状伪足的计数是在每个处理组中随机选取35个以上的神经细胞，统计其轴突和若干个树突上一段30至80微米长度的距离上丝状伪足的个数，然后算出其密度值(个数/10微米)，每个独立实验至少重复3次，最后将其密度值用统计学软件进行分析。
　　 结果:
　　 1.TrkB受体两种亚型(TrkB-FL和TrkB.T1)在大鼠坐骨神经内都有顺轴突转运趋势
　　 成年大鼠坐骨神经中段结扎一天后，取结扎口附近的坐骨神经提取蛋白进行western blot试验检测其中的TrkB-FL和TrkB.T1的水平发现：相对于非结扎侧坐骨神经，TrkB-FL的量在结扎口的近端增多(代表顺轴突转运)，在结扎口的远端也增多(代表逆向轴突转运)。从而验证了以前文献的报道：TrkB受体既存在顺轴突转运也存在逆轴突转运。此外，还发现TrkB受体的截短突变体TrkB.T1(缺少了酪氨酸激酶区)也能够进行顺向转运，有文献报道，TrkB受体可以通过其酪氨酸激酶区与Slp1/Rab27B/CRMP-2/kinesin-1结合而进行顺向轴突转运(1)，而本实验中发现TrkB受体的截短突变体TrkB.T1(缺少了酪氨酸激酶区)也能够进行顺向转运，说明了存在有不依赖于TrkB受体的酪氨酸激酶的转运机制存在；目前已知TrkB受体与其截短突变体TrkB.T1在近膜区有12个氨基酸序列是完全相同的，而这12个氨基酸也许在TrkB受体顺轴突转运机制中起到关键性的作用。通过用TrkB受体全长型与TrkB.T1的共同12个氨基酸序列做成诱饵进行酵母双杂交试验，发现了35个阳性克隆，其中3种都是编码JIP3蛋白的(结果未显示)。而JIP3蛋白已被发现在依赖于kinesin-1的顺向转运中起到衔接蛋白的作用，因此我们推测JIP3蛋白能够介导TrkB受体顺向转运。
　　 2.JIP3与TrkB在体外与体内都存在有部分共定位
　　 首先将海马神经元细胞体外培养5天，用免疫荧光法看内源性JIP3与TrkB在神经元细胞内的亚细胞定位，结果表明：含有TrkB受体的囊泡分布于体外培养的神经元的核周区域以及轴突和树突分布区，且与JIP3的分布情况存在部分共定位。为了进一步验证其在体内的共定位情况，我们将大鼠坐骨神经结扎一天后，取材切片进行免疫组化染色，观察到TrkB受体在结扎口近端有明显的聚集，且与JIP3蛋白有较多共定位。
　　 然后我们用免疫共沉淀法检测JIP3与TrkB是否形成复合体。①在HEK29细胞中过表达各种质粒并进行免疫共沉淀实验，结果显示Flag-TrkB-FL和Flag-TrkB.T1都可以和HA-JIP3形成复合体；但是同等量的情况下Flag-TrkB.T1与HA-JIP3结合比Flag-TrkB-FL结合要弱。②我们还进行了生理条件下的免疫共沉淀实验，来进一步检测JIP3与TrkB是否形成一个复合体。取大鼠大脑匀浆，用内源性JIP3抗体进行免疫共沉淀实验，然后用内源性KLC1抗体、内源性TrkB抗体进行检测，结果表明TrkB/JIP3/KLC1形成一个复合体。
　　 3.JIP3是介导TrkB与KLC1结合的衔接蛋白，并与二者形成TrkB/JIP3/KLC1复合体
　　 为了研究究竟哪个分子是介导TrkB与KLC1结合的中间桥梁，我们进行3个分子共表达的免疫共沉淀实验，结果发现：JIP3是介导TrkB与KLC1结合的衔接蛋白，但敲除掉JIP3表达时，TrkB与KLC1结合并未完全消失；而同时敲除JIP3和Rab27B时，TrkB-FL与KLC1的结合能力比单敲除掉JIP3或者单敲除掉Rab27B时降低的更多。以上结果表明：TrkB-FL既可以通过JIP3蛋白的衔接作用与KLC1相互作用，也可以通过Sip1/Rab27B/CRMP-2复合体与KLC1相互作用，这两种方式是同时存在的。
　　 4.TrkB受体中与JIP3蛋白结合的精确区域是近膜1区的12个氨基酸，它们是TrkB受体与JIP3蛋白结合的必要条件和充分条件
　　 为了研究TrkB受体中与JIP3蛋白结合的精确区域，我们构建了以下TrkB突变体：JM区只含有这12个氨基酸的突变体FlagTrkB-JM1，JM区完全缺失的突变体FlagTrkB-JM0，以及仅缺失这12个氨基酸的缺失突变体FlagTrkB△JM1。免疫共沉淀结果表明：TrkB-JM1不仅是TrkB/JIP3结合的必要条件，同样也是TrkB/JIP3结合的充分条件。而嫁接了TrkB-JM2，TrkB-JM3后能增强TrkB/JIP3的结合，从而解释了之前的实验结果(同等量的情况下TrkB.T1与JIP3结合比-FL结合要弱)。
　　 众所周知，酪氨酸激酶受体有常见的三种形式：TrkA，TrkB，TrkC。因此我们通过免疫共沉淀实验来研究JIP3蛋白是否与这3种受体都有相互作用。结果发现：JIP3除了与TrkB受体结合以外，还能与TrkC受体结合，而不与TrkA结合。
　　 5.JIP3蛋白分别通过其CC1区域和LZ区域与TrkB受体和KLC1结合，且JIP3CC1与TrkBJM1区域是直接结合的
　　 为了寻找JIP3蛋白中与TrkB受体结合的的精确区域，我们构建了一系列的JIP3缺失突变体，并且用免疫共沉淀方法检测其与TrkB-FL受体结合的能力。结果表明：JIP3蛋白的424-625氨基酸序列对JIP3蛋白和TrkB受体的结合起到关键性作用。这段氨基酸序列中包含有3个保守序列，分别是：亮氨酸拉链区(leucine Zipper-like domain，LZ)，环区1(coiled-coil1，CC1)，环区2(coiled-coil2，CC2)。为了寻找更加精确的结合区域，我们构建了分别缺失LZ，CC1，CC2的JIP3突变体，免疫共沉淀实验结果表明：JIP3蛋白分别通过其CC1区域和LZ区域与TrkB受体和KLC1分子马达结合。且缺失了CC1区域JIP3蛋白能够作为一个功能缺失的突变体(dominant negative，DN)来研究JIP3对TrkB受体的转运和调节。
　　 为了验证TrkB与JIP3是直接结合而非间接的，我们运用体外的GST融合蛋白沉降技术来检测TrkB/JIP3的相互作用，实验结果显示：JIP3-CC1区域能够直接与TrkB-JM1区域结合；TrkB-JM2，TrkB-JM3之间的区域能够增强这种结合作用，这与我们之前的免疫共沉淀结果是相符合的。
　　 6.JIP3蛋白介导了TrkB受体在神经元轴突中的顺向转运而不影响树突中的顺向转运
　　 前面我们的实验结果表明：TrkB/JIP3/KLC1形成一个复合体，我们猜测JIP3蛋白能够介导TrkB受体利用KLC1进行顺向转运。为证实此猜想，我们用免疫荧光法检测过表达JIP3，或者敲除掉内源性JIP3对TrkB-FL-GFP在分化的PC12细胞末梢的分布的影响。在该实验的对照组(转染随机无意义干扰RNA组)中，TrkB-FL-GFP可以聚集到分化的PC12细胞末梢，而转染特异性针对JIP3序列的干扰RNA(siJIP3)或者JIP3的功能缺失体JIP3△CC1后，到达分化的PC12细胞末梢的TrkB-F-GFP显著减少。与之相反，过表达JIP3能够显著增加到达分化的PC12细胞末梢的TrkB-FL-GFP量。以上结果表明：JIP3能够促进分化的PC12细胞中TrkB-FL-GFP的顺向转运。
　　 为了研究内源性表达的TrkB受体，在神经元中的转运是否能够被JIP3增强，我们在体外培养的原代海马神经元中重复了以上实验。统计结果显示：过表达JIP3能够使得转运到轴突末梢的TrkB受体显著增多，反之亦然，过表达JIP3的功能缺失体JIP3△CC1或者转染了siJIP3能够使得转运到轴突末梢的TrkB受体明显减少，而以上3种处理方式对于到达树突末梢的TrkB受体不受影响。同时敲除JIP3和Rab27B，与单独敲除JIP3或Rab27B组相比，可以使到达轴突末梢的TrkB受体减少到更低。这再次验证了之前的结果，即TrkB-FL既可以通过JIP3蛋白的衔接作用与KLC1相互作用，也可以通过Slp1/Rab27B/CRMP-2复合体与KLC1相互作用，这两种机制是同时存在的，且是亚相加(subadditive)的。
　　 7.活细胞成像结果：JIP3对轴突中TrkB受体顺向转运起特异性作用，而对树突中TrkB受体运动无影响
　　 为了进一步研究JIP3对TrkB受体顺向转运的影响，我们将神经元细胞转染TrkB-FL-mRFP后体外培养五天，用荧光显微镜观测含有TrkB-FL-mRFP的囊泡转运情况，结果显示囊泡在神经元轴突中运动更加活跃，可以见到囊泡沿着轴突进行顺向、逆向、双向转运以及静止不动，而在树突中运动要相对少的多。为了便于定量分析，我们人为的将含有TrkB-FL-mRFP的囊泡在神经元中的运动情况可以分为四类：(1)顺向转运的，(2)逆向转运的，(3)双向转运的，(4)相对静止不动的。统计结果显示：(1)轴突和树突中以上四种运动方式的囊泡所占比例大致相似。(2)与对照组相比，siJIP3组中含有TrkB-FL-mRFP的囊泡进行顺向轴突转运的比例明显减少，而轴突中静止不动的囊泡比例相应升高。(3)siJIP3组中树突中的4种囊泡的比例不变。以上结果表明：JIP3特异性的对轴突中TrkB受体顺向转运起作用，而对树突中TrkB受体运动无影响。
　　 8.依赖于JIP3的TrkB受体顺向转运，对于BDNF的信号转导有重要作用
　　 为了研究JIP3介导的TrkB受体顺向转运对于后续功能的影响，我们研究了JIP3是否影响BDNF介导的信号转导。在海马神经元培养液中加入50ng/mlBDNF15分钟，来激活Erk1/2是一种很好的建立的TrkB受体激活的方法。由于神经元细胞的转染效率低，我们用免疫细胞化学的方法来检测BDNF激活的磷酸化的Erk1/2(p Erk1/2)。敲除掉内源性JIP3后，在总Erk1/2水平不变的情况下，磷酸化Erk1/2水平降低了大约35％，反之，在过表达JIP3组中，Erk1/2磷酸化水平升高了大约40％。JIP3对于BDNF诱导的Erk1/2磷酸化水平的影响，在轴突末梢处比整个细胞的影响更为明显。
　　 9.JIP3不能够促进TrkB受体的细胞膜表面插入
　　 根据本实验室以前的文献报道(2)，我们使用了TrkB受体细胞膜表面分布比例的荧光定量方法：海马神经元转染Flag-TrkB-FL-GFP，以及各组质粒ScramblesiRNA，HAJIP3，siJIP3，siRab27B，并观察神经元轴突末梢总的TrkB量以及膜表面的TrkB量的变化情况。结果显示：过表达JIP3或者敲除掉JIP3能够使得轴突远端的总TrkB-FL以及膜表面的TrkB-FL都相应的增多或者减少，而不论何种干预，TrkB-FL膜表面/总量的比值保持不变。以上结果表明：顺轴突转运的TrkB-FL能够成功插入到膜表面而且JIP3对TrkB受体的膜表面插入无显著影响。
　　 10.JIP3能够影响BDNF作用下海马神经元轴突上丝状伪足的形成
　　 已有文献表明(3)，BDNF/TrkB信号能够驱动活性依赖的突触形态发生。为了研究JIP3依赖的TrkB转运在BDNF引发的突触形态发生中的作用，我们研究了JIP3是否能调节BDNF刺激引起的丝状伪足形成。将海马神经元分别转染Scramble siRNA，siJIP3，JIP3△CC1，JIP3FL后，用BDNF刺激20分钟，然后固定细胞检测丝状伪足的形成情况并加以统计。统计结果表明：siJIP3组和JIP3△CC1组的BDNF刺激后丝状伪足没有明显增加，而过表达JIP3组BDNF刺激后轴突上丝状伪足数目明显增多，且有统计学差异。与之相反，JIP3对于树突上丝状伪足数目的增加没有任何调节作用。以上结果表明，JIP3可以选择性影响轴突上丝状伪足的形成，且是由于JIP3对BDNF信号的影响来调控的。
　　 结论:
　　 1、JIP3是介导TrkB与KLC1结合的衔接蛋白，并与其形成TrkB/JIP3/KLC1复合体。
　　 2、TrkB受体中与JIP3蛋白结合的精确区域是近膜区的12个氨基酸，它们是TrkB受体与JIP3蛋白结合的必要条件和充分条件。
　　 3、JIP3蛋白的CC1区域和LZ区域分别与TrkB与KLC1结合，且JIP3-CC1区域与TrkB-JM1区域是直接结合的。
　　 4、JIP3蛋白介导了TrkB受体在神经元轴突中的顺向转运，而不影响树突中的顺向转运。
　　 5、依赖于JIP3的TrkB受体顺向转运，对于BDNF的信号转导有重要作用。创新点
　　 创新点一，本研究中首次发现：JIP3能够直接与TrkB受体结合并且将TrkB受体与驱动蛋白kinesin-1相连接从而沿着微管进行顺向转运。
　　 创新点二，JIP3选择性的介导TrkB受体在轴突中进行顺向转运而对其在树突中的转运无影响。
　　 创新点三：JIP3介导的TrkB受体在轴突中的顺向转运可以调节BDNF功能。