心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

摘要

传统观点认为，成人神经细胞损伤后无法再生，功能无法重建，以致中枢神经系统损伤及变性疾病患者的神经功能很难恢复。近年研究发现，在胚胎期和成年期哺乳动物神经系统中存在具有自我增殖、自我更新和多向分化潜能的神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)，神经干细胞由胚胎早期的神经上皮细胞产生，能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，神经干细胞的发现对中枢神经系统不能再生的传统理论提出了挑战，为研究神经细胞的再生和功能重建带来了新前景。然而，自然情况下，神经干细胞大部分分化为胶质细胞，仅少量分化为神经元，目前尚无法有效控制神经干细胞定向分化为特定的神经细胞，因此，如何调控NSCs定向分化为功能性神经元成为神经科学研究领域的热点和难点之一。心脉隆注射液(xinmailonginjection，XML)是从昆虫美洲大蠊体内提取的核苷类化合物，有实验研究结果表明，美洲大蠊提取物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、促血管增生和组织修复、清除自由基等作用。本实验旨在观心脉隆注射液对体外培养神经干细胞增殖分化作用的影响，探讨其是否可以诱导神经干细胞向神经元分化。
　　 目的:
　　 建立新生SD大鼠海马神经干细胞体外分离培养方法;并鉴定神经干细胞;探讨心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化作用的影响。
　　 方法:
　　 1、从新生24h内SD大鼠脑组织中分离海马，采用无血清悬浮培养，并进行传代培养，相差显微镜观察细胞形态，将第3代以免疫细胞化学法检测Nestin、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu）表达和神经干细胞分化后微管相关蛋白2(microtubule-associatedprotein2，MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）的表达。
　　 2、将终浓度为0.5％、1％、2％的心脉隆注射液加入到第3代神经干细胞单细胞悬液中有血清贴壁培养并分实验组和对照组。每3d更换分化培养基1次，干预5d后倒置显微镜下观察神经干细胞的形态。
　　 3、采用免疫荧光化学染色，观察分化后细胞MAP-2、GFAP表达情况，应用ImageProplus6.0软件计数MAP-2阳性细胞数，并计算分化率。
　　 4、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）观察心脉隆注射液对神经干细胞增殖能力的影响。
　　 5、将终浓度为2％的心脉隆注射液加入到第3代神经干细胞单细胞悬液中有血清培养，并设立对照组，5～7d后用RTQ-PCR法检测神经元特异性烯醇化酶表达量。
　　 6、应用流式细胞术检测心脉隆注射液对神经干细胞凋亡的影响。
　　 结果:
　　 1、从新生SD大鼠海马中分离培养的细胞具有增殖、自我更新和分化的能力，神经球免疫化学染色Nestin、BrdU阳性，由其分化的细胞一部分神经元特异性标记物MAP-2阳性、一部分星形胶质细胞标记物GFAP阳性。
　　 2、倒置显微镜下观察，与对照组相比，心脉隆注射液干预组分化出更多的神经元细胞，且免疫荧光化学染色后实验组明显高于对照组，其差异具有统计学意义(p＜0.05）。
　　 3、四甲基偶氮唑盐比色法结果显示，细胞培养5d后，XML干预组OD值高于空白对照组，差异具有统计学意义（p＜0.05）。
　　 4、荧光实时定量PCR结果显示，实验组神经元特异性烯醇化酶表达量大于对照组，具有统计学差异。
　　 5、流式细胞检测结果显示，各实验组和对照组之间凋亡率无明显差异。
　　 结论:
　　 1、本实验成功分离培养出神经干细胞，并且在体外扩增、传代，诱导分化后形成神经元和胶质细胞，二者免疫荧光化学染色分别呈MAP-2和GFAP阳性。
　　 2、心脉隆注射液能够在一定程度上促进神经干细胞增殖。
　　 3、心脉隆注射液可以促进神经干细胞向神经元方向分化。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 新生SD大鼠海马神经干细胞的体外培养和鉴定

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 心脉隆注射液对海马神经干细胞的增殖分化的作用

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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