鞘脂代谢物对维甲酸类药物肿瘤抑制过程中的影响

摘要

研究背景:
　　 鞘脂是真核细胞膜的主要成分，能代谢产生多种重要的信号分子。在鞘脂代谢物中，神经酰胺(Cer)和鞘氨醇磷酸(S1P)与癌症的发生和发展密切相关。Cer具有肿瘤抑制作用，能够抑制肿瘤细胞增长、促进细胞凋亡;而S1P则被认为具有促癌作用。细胞内Cer和S1P的动态平衡往往决定着细胞是处于增殖还是凋亡状态。
　　 维甲酸类药物是维生素A的结构及功能类似物的总称，这类物质对于调节细胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用。维甲酸类药物的作用主要由核内受体维甲酸受体(RAR)和维甲类X受体(RXR)介导，通过激活RAR/RXR二聚体促进含有RXRs或RARs识别元件的靶基因转录而实现。维甲酸受体的表达缺失是癌症发生过程中的常发与重要事件，这可能导致肿瘤对维甲酸类药物产生耐药性。除了促进靶基因转录外，维甲酸受体RXRα还可能进入细胞质发挥重要作用，其中RXRα与孤儿受体TR3以二聚体形式进入胞质，引起细胞凋亡，这被认为是非常重要的促进细胞凋亡途径之一。
　　 本课题主要进行以下方面的研究:(1)Cer是否通过RXRα出核机制诱导细胞凋亡？(2)S1P对维甲酸类药物肿瘤抑制作用的影响及产生机制。
　　 该项研究的对于深入了解鞘脂类代谢产物影响维甲酸受体胞内定位，功能改变和信号通路的异常传导十分重要，同时其发现的S1P介导肿瘤产生对维甲酸类药物产生耐药性、发现新靶点和设计维甲酸衍生物具有指导意义。
　　 实验方法:
　　 1.Cer促进RXRα出核的意义
　　 以免疫荧光染色法检测人肝癌SMMC-7721和肺癌H460细胞内源性RXRα在Cer作用下的胞内定位变化，以Westernblotting法确认细胞中Cer促使RXRα出核现象。以瞬时转染法检测外源性表达的GFP-RXRα在Cer作用下能否由核内迁移进入胞质。以荧光素酶报告基因法分析293A细胞中Cer能否拮抗9-cis-RA促进RAR/RXR对含有维甲酸识别元件(RARE)的报告基因转录水平。以MTT法分析Cer抑制SMMC-7721与SMMC-7721/RXRα细胞生长程度的差异。以Westernblotting法检测SMMC-7721和H460细胞中不同时间点的RXRα表达量及cleavedPARP表达变化。
　　 2.S1P引起肿瘤细胞对维甲酸类药物耐药的机制研究
　　 以MTT法检测不同浓度S1P对SMMC-7721和PLC/PRF/5细胞生长的影响，以流式细胞仪检测S1P能否解除全反式维甲酸(ATRA)所致的细胞G1期阻滞作用。以Westernblotting法和实时定量PCR法检测S1P对ATRA诱导细胞RARβ表达的影响，以荧光素酶报告基因检测法分析S1P能否拮抗ATRA对含有RARE的报告基因的转录促进作用。
　　 以免疫荧光染色和瞬时转染法分析细胞中RXRα和鞘氨醇激酶2(Sphk2)定位的一致性，以免疫共沉淀法检测Sphk2和RXRα能否结合。在HT-29细胞中瞬时转染HA-Sphk2和空载体，以Westernblotting法和半定量RT-PCR法检测外源表达的Sphk2能否抑制ATRA和RXR激动剂LGD1069促进RARβ转录和表达的作用，在293A和HT-29细胞中，以荧光素酶报告基因检测法分析Sphk2能否抑制ATRA和9-cis-RA对含有RARE的报告基因的转录促进作用。
　　 以半定量RT-PCR法检测蛋白酶体抑制剂MG132能否解除S1P抑制ATRA促进RARβ转录的作用。以Westernblotting法检测RXRα在LGD1069和ATRA存在时的蛋白降解能否被S1P增强，以及S1P促进对RARβ在ATRA存在时的修饰和降解。
　　 实验结果:
　　 1.Cer能够促进RXRα由细胞核迁移进入细胞质
　　 在含有0.5％血清的培养基中，以10μM的Cer处理12小时后，H460和SMMC-7721细胞均出现凋亡特征，同时RXRα出核进入细胞质中。Westernblotting实验确认了Cer引起SMMC-7721细胞的RXRα出核现象。在SMMC-7721细胞瞬时转染GFP-RXRα，Cer处理10h后，荧光显微镜发现RXRα已经进入细胞质中。
　　 2.Cer引起细胞凋亡的作用并不依赖于RXRα出核诱导凋亡这一途径
　　 荧光素酶报告基因检测实验证明，Cer不影响9-cis-RA促进RXR/RAR对靶基因的转录。在建立的SMMC-7721/RXRα稳定表达细胞中RXRα表达量明显增高，而MTT结果显示Cer对SMMC-7721/RXRα和SMMC-7721细胞生长抑制作用差异并不显著。在Cer诱导SMMC-7721细胞凋亡的过程中，3h时cleavedPARP明显增多，至12h达高峰;而RXRα表达量在9h下降，第12h下降14.2％，这两个时间点正是RXRα出核最明显之处。Cer所致的RXRα降解在H460细胞中尤为明显。
　　 3.S1P拮抗ATRA和LGD1069抑制细胞生长作用
　　 MTT结果显示:与10μMATRA单独作用比较，合用0.01或0.1μMS1P后，HT-29细胞增殖水平分别增加了15.1％和26.2％，H460细胞增殖增加了14.0％和15.2％。与10μMLGD1069单独作用相比，合用1μM的S1P时，A549细胞数增加33.5％，而HCT116细胞增加29.8％。进一步分析发现，ATRA(5μM)能够引起HT-29细胞G1期阻滞，合用S1P(0.1μM)，则能解除ATRA引起的细胞G1阻滞。
　　 4.S1P拮抗ATRA诱导RARβ表达作用
　　 Westernblotting结果显示:ATRA(1μM)能使HT-29和SMMC-7721细胞RARβ表达量明显增加，S1P则能抑制ATRA对RARβ表达的诱导作用。Real-timePCR结果显示:S1P的上述拮抗作用具有时间依赖性。荧光素酶报告基因实验发现:S1P浓度为0.001，0.01和0.1μM时，RARE转录活性与ATRA单独作用相比分别下降7.8，19.4和37.3％。
　　 5.Sphk2与RXRα能结合并抑制ATRA和LGD1069对RXR/RAR的激活
　　 与内源性表达的Sphk2和RXRα相同，在HT-29细胞中转染的HA-Sphk2和GFP-RXRα均位于核内，而在TPA刺激下均进入胞质中。以免疫共沉淀实验发现Sphk2与RXRα能够结合，而Sphk1则不能与之结合。RT-PCR和Westernblotting结果表明:转染了Sphk2的细胞，ATRA和LGD1069诱导RARβ的转录和表达水平明显减少。荧光素酶报告基因实验证明:随着Sphk2剂量增加，ATRA和9-cis-RA促进报告基因转录的作用随之下降。
　　 6.S1P拮抗ATRA诱导RARβ表达作用与蛋白酶体降解途径有关
　　 以半定量RT-PCR结果发现，与ATRA单独作用相比，S1P和ATRA联合作用时HT-29细胞RARβ的mRNA表达量下降了41.8％;而当ATRA，S1P和MG132联合作用时，仅比ATRA单独作用降低了7.7％。
　　 7.S1P促进维甲酸受体配体依赖性降解
　　 Westernblotting结果证明:LGD1069单独作用时RXRα产生了配体依赖性降解，当S1P与LGD1069联合作用时，RXRα表达量进一步下降47.3％。ATRA能够诱导RXRα的降解作用，但ATRA与S1P合用时RXRα的量比ATRA单独作用时反而增加了91.7％，说明RARβ表达水平的降低可能导致RXRα不能被ATRA诱导降解。当ATRA和MG132合用时，在RARβ上方出现了新条带，合用S1P后条带加深。用抗乙酰化赖氨酸抗体检测发现ATRA和MG132合用时也出现了一条新条带，当ATRA,MG132和S1P联合作用时条带也加深，初步推测是RARβ发生了乙酰化修饰。
　　 实验结论:
　　 1.由Cer引起的RXRα出核现象可能并不直接引起凋亡作用，其出核的直接作用可能与Cer诱导细胞凋亡时蛋白的降解作用有关。
　　 2.S1P通过增强维甲酸受体的配体依赖性降解作用，进而抑制维甲酸类药物促进靶基因的转录，致肿瘤细胞对维甲酸类药物产生耐药性。
　　 3.高表达的Sphk2能抑制维甲酸类药物促进RXR/RAR对靶基因转录的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．鞘脂及其代谢

1．1．神经酰胺与细胞凋亡

1．2．鞘氨醇激酶及其产物鞘氨醇磷酸与癌症的发生密切相关

2．维甲酸信号通路

2．1．RXRα能进入细胞质中发挥重要作用

2．2．癌症的发生与维甲酸信号通路的异常有关

3．鞘脂代谢产物参与调控维甲酸信号通路

第一部分 神经酰胺引起RXRα出核的意义

1．材料

1．1．化合物

1．2．细胞株

1．3．菌株

1．4．质粒

1．5．试剂

1．6．试剂配制

1．7．仪器设备

2．实验方法

2．1．大肠杆菌的转化(CaCl2法)

2．2．质粒提取(QLAGEN试剂盒)

2．3．C2GFP-RXRα稳定表达细胞系的建立

2．4．免疫荧光染色

2．5．细胞凋亡分析(Hochest33258染色)

2．6．瞬时转染

2．7．细胞增殖分析(MTT法)

2．8 转录活性调控分析(荧光素酶报告基因检测法)

2．9．Western blotting

2．10．细胞核质分离

2．11 数据处理

3 实验结果

3．1 在Cer引起的细胞凋亡过程中存在RXRα出核现象

3．2 Cer不影响RXRα／RARβ对靶基因的转录活性

3．3 Cer对细胞生长的抑制与RXRα表达量无关

3．4 RXRα出核可能是与凋亡引起的蛋白降解有关

4 讨论

第二部分 S1P引起肿瘤细胞对维甲酸类药物耐药机制研究

1．材料

1．1．化合物

1．2．细胞株

1．3．质粒

1．4．抗体

1．5．试剂盒

1．6．其他重要试剂

2．实验方法

2．1．半定量RT-PCR

2．2．实时定量PCR

2．3．转录活性调控分析(荧光素酶报告基因检测法)

2．4．外源性表达Sphk2对ATRA和LGD诱导的RARβ表达的影响

2．5．免疫共沉淀

2．6．TPA对Sphk2与C2GFP-RXRα胞内定位的影响

2．7．细胞周期分析

2．8．其他实验方法同第一部分

2．9．数据处理

3．实验结果

3．1．低浓度的S1P促进细胞生长而高浓度产生抑制作用

3．2．S1P拮抗ATRA抑制细胞生长的作用

3．3 S1P具有拮抗LGD1069抑制细胞生长的作用

3．4．S1P解除ATRA引起的HT-29细胞G1期阻滞

3．5．ATRA促进PARβ转录和表达的作用能被S1P拮抗

3．6．S1P拮抗ATRA对含有维甲酸反应元件的基因的转录

3．7．Sphk2的胞内分布与RXRα有一致性

3．8．外源性表达的Sphk2能拮抗维甲酸类药物诱导的RARβ的表达

3．9．蛋白酶体抑制剂MG132能阻断S1P的拮抗作用

3．10．S1P可促进RXRα受体配体依赖性降解

3．11 S1P促进了RARβ的修饰和降解

3．12 S1P拮抗维甲酸类药物促进靶基因转录作用的可能机制分析

4．讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文

学位论文评阅及答辩情况表