肝脏遗传性出血性毛细血管扩张症的临床基础研究

摘要

研究背景和意义
　　 遗传性出血性毛细血管扩张症(HereditaryHemorrhagicTelangiectasia，HHT)亦称Osler-Weber-Rendu病，是一种由转化生长因子β(TransformingGrowthFactorβ，TGF-β)信号通路相关基因突变导致血管形成发育障碍而引起的涉及鼻、口腔、唇、舌、四肢等全身皮肤粘膜以及肝、肺、脑、胃肠道等内脏器官的全身性疾病。该病属于常染色体显性遗传病，但不完全外显，存在散发性病例，其纯合子病人尚无文献报道，杂合子病人因“单倍剂量不足”出现随年龄增长而不断进展的病症。患者的发病情况、受累脏器、临床表现及预后存在较大的个体间差异，给该病的早期临床诊断和治疗造成困难。2002年日本秋田县（人口约120万）开展了HHT的流行病学调查，结果显示当地该病的发病率为1/8000-1/5000，与欧美国家相比较，亚洲尤其东亚地区或许是HHT的高发区域。
　　 上世纪八十、九十年代，国外开展的病例回顾性研究表明HHT肝脏受累的比例为8-31％。然而，随着影像技术的进步和筛查方法的改进，近年来肝脏受累的病例报道逐渐增多，而HHT肝脏受累的比例也不断增高。2004年，Buscarini利用彩超对64个HHT家系进行肝脏筛查，发现41.4％的HHT患者存在肝血管畸形;而非家系选择性队列研究中，影像学筛查发现67％-84％的HHT患者病变累及肝脏，其中Buonamico于2008年报道的肝脏受累比例高达84％。因此，HHT肝脏受累的相关研究必然地成为了HHT研究的重要部分，而“肝脏遗传性出血性毛细血管扩张症(HepaticHereditaryHemorrhagicTelangiectasia，HHHT)”的概念也逐渐被接受。
　　 HHHT的大多数患者起初无明显症状，亦无特异性体征，有症状而就诊者比例不足15％，而具备充血性心力衰竭、门脉高压、胆系症状等典型症状的患者更少，容易漏诊、误诊。有学者提出了诊断HHT的经验性的“Cura(c)ao标准”，但具体到肝脏（即HHHT），其特异性、敏感性受到质疑，临床指导意义有限。影像学检查方面，作为血管畸形诊断“金标准”的血管造影逐渐被无创性检查技术取代，但该病彩超、CT的诊断标准尚未统一。国外HHHT相关的基因检查已开展，然而，不同致病位点被陆续发现，且有新的致病基因被报道（如MADH4基因）。由于其家族特异性遗传特点，对于未知突变基因的病人以及无家族遗传背景的患者，基因诊断困难。因此，HHHT的临床诊断策略有待进一步完善。
　　 与此同时，HHHT的治疗方案，尤其外科治疗也没有达成共识，值得深入探讨。广义的HHHT外科治疗主要包括肝动脉介入栓塞、肝动静脉瘘结扎、缩扎术、肝移植术。介入治疗利用栓塞剂或不锈钢圈栓塞动静脉瘘的供血血管，具有创伤小、显效快特点，但随访发现术后易复发，且能引起胆道甚至肝组织缺血坏死。肝动静脉瘘结扎及扩张的动脉瘤结扎术，手术创伤较大，术后并发症较多，部分患者术后也出现局部肝组织和胆道缺血坏死。2006年《AnnalofSurgery》总结了1985年-2003年欧洲14个医疗中心开展的40例HHHT肝移植的情况:60％出现移植后并发症;20％移植后死亡;另有2例疑似复发。
　　 近年来，国内相关肝脏遗传性出血性毛细血管扩张症(HHHT)报道逐渐增多，但遗憾的是，国内尚无较为系统的病例分析和临床研究。针对国内HHHT的系统临床病例研究的空白及诊断方法和治疗方式的争议，我们课题组随访调查了山东济南、淄博桓台、聊城莘县、临沂蒙阴以及上海、浙江衢州、河南郑州、河北石家庄等地的HHHT病例，采集了临床资料和家系信息。本研究（第一部分）整理并回顾性分析了2002年-2011年山东大学齐鲁医院以及山东、河南、河北、浙江等地合作医疗单位诊治的15例HHHT患者临床资料，对HHHT的临床表现、病理、诊断、治疗及预后进行总结、分析，初步提出了HHHT的诊断策略、个体化治疗方案以及肝动脉结扎术式的改进方法。
　　 HHHT的遗传学背景是转化生长因子β(TGF-β)受体超家族相关编码基因的突变:HHT1型致病基因为ENG(endoglin)，位于9号染色体长臂(9q33-34)，编码TGF-β的细胞表面协同受体endoglin;HHT2型致病基因为ALK-1(activinreceptor-likekinase1)，位于12号染色体长臂(12q13)，编码ALK-1(或ACVRL1)，是TGF-βⅠ型受体的一种。ENG和ALK-1主要存在于内皮细胞尤其血管内皮细胞表面，在血管形成、发育方面具有重要作用。目前新发现其他4个基因与HHT相关，其中除了5号染色体和7号染色体上的2个致病基因功能尚不明确外，MADH4基因和BMPR2基因都与TGF-β信号通路相关，而位于18号染色体(18q21)的MADH4，编码TGF-β受体的激酶底物——Smad4，对TGF-β信号传导具有重要作用。
　　 TGF-β参与人体诸多生命过程的调控，如细胞生长分化、胚胎发育、血管形成，而其信号通路的传导异常可引发肿瘤、HHT等多种疾病。现代分子生物学研究已经基本明确TGF-β信号传导过程，即当TGF-β与其细胞表面受体(TGF-βreceptor，TβR)结合后，诱导受体TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ形成复合体，TβR-Ⅱ催化TβR-Ⅰ结构域的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，从而活化TβR-Ⅰ，再作用于细胞内底物，如SMAD家族，完成细胞信号传导。正是由于TGF-β细胞表面受体和细胞内SMAD家族结构和功能不同，激活或抑制基因表达，使TGF-β产生不同生物学效应。其中，Smad分为3类:即受体活化型(R-Smad)、共同通路型(Co-Smad)和抑制型(I-Smad)。R-Smad(包括Smad2、Smad3)和Co-Smad(即Smad4)是TGF-β信号正常传导所需介质;而I-Smad(如Smad7)则能抑制TGF-β的信号传导。ENG、ALK-1及MADH4基因的突变使TGF-β细胞表面相关受体及下游Smad4异常，阻碍了TGF-β正常信号传导，导致血管生成发育障碍，引发HHT。
　　 因此，我们设想:增强TGF-β传导通路，尤其增强TGF-β受体或Smad4功能的干预措施，或许能起到一定治疗效果或延缓HHT的病情发展。我们尝试寻找TGF-β通路的正性调控因子，而RNF11可能就是这样一种调节蛋白。
　　 环指蛋白11(Ring-FingerProtein11，RNF11)是最早由肿瘤cDNA文库中克隆出来的具有环指结构的蛋白，经免疫共沉淀法发现其能与近80种不同类型和功能的细胞内蛋白作用，并且发现其能通过自身直接作用及泛素化等间接作用调节TGF-β通路和表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)通路，被认为是细胞信号和转录调节的交叉点。泛素-蛋白酶体系统是目前已知最重要的蛋白质降解体系，参与基因表达、转录调节、信号传递、细胞增殖、凋亡、分化等几乎一切生命活动的调控。而RNF11是一种包含多个结构域的调节蛋白，其中包括一个泛素结合结构域，能通过泛素化途径对受体、转录因子、信号蛋白进行调控。Smurf2（一种泛素化连接酶）是已知的TGF-β信号的高效负性调节因子:一方面能促进Smad2降解而下调TGF-β信号，另一方面能与Smad7作用以抑制TGF-β信号传导并促进TGF-β受体降解。国外学者报道RNF11或许能通过阻断Smurf2活性和直接增强Smad4活性的方式以增强TGF-β信号。
　　 因此，我们选取环指蛋白11(RNF11)作为可能延缓HHHT病情发展或治疗HHHT的因子。本研究（第二部分）中，我们成功构建了RNF11过表达真核载体，通过脂质体转染方法对体外肝细胞系(ChangLiver)的增殖进行干预，观察RNF11是否能够增强TGF-β1的增殖抑制能力，论证RNF11对TGF-β通路的正性调节作用，为我们课题组之后应用TGF-β通路相关调节因子调控血管生成及治疗HHHT相关实验研究做前期准备。
　　 第一部分
　　 肝脏遗传性出血性毛细血管扩张症的诊断策略和个体化治疗
　　 目的
　　 总结肝脏遗传性出血性毛细血管扩张症(HepaticHereditaryHemorrhagicTelangiectasia，HHHT)的诊治经验，探讨其临床诊断策略和治疗方案。
　　 方法
　　 回顾性分析15例HHHT患者的临床症状、体征、实验室检查、组织病理学检查、影像学检查、治疗方法和临床效果及预后资料。
　　 结果
　　 1、HHHT早期无特异性临床表现，可出现上腹痛、贫血、气短、肝区杂音等，但可能迅速进展，出现门脉高压、肝硬化、充血性心力衰竭等并发症;
　　 2、彩超、CT显示肝内弥漫性或局灶性毛细血管扩张、动静脉瘘、肝动脉迂曲扩张甚至动脉瘤形成;数字减影血管造影(DSA)对多支肝动脉的复杂患者，血管显影欠佳，而计算机断层扫描血管造影(CTA)则显示清晰;
　　 3、组织病理学检查示肝内弥散性或局灶性毛细血管扩张灶以及交替出现的再生和萎缩，部分肝组织呈现“窦性扩张”特点;局部出现灶性结节性增生及硬化样改变;免疫组化染色显示HHHT患者肝组织TGF-β1强阳性;
　　 4、手术6例，其中5例患者接受肝动脉结/缩扎术，随访效果满意;血管介入治疗3例，其中1例存在多支肝动脉的复杂型患者介入栓塞失败，药物治疗30月后病逝;4例仅行药物治疗，随访彩超、CT示肝脏病变逐渐加重;2例起始无症状，但21月、35月后分别出现肝功异常、腹水等症状，其中1例病逝。
　　 结论：
　　 依据“充血性心力衰竭、门脉高压、胆系病变”三项主要临床表现，参照家族史和累及其他脏器所导致的相应症状和体征，以“肝内毛细血管扩张、动静脉瘘、肝动脉迂曲扩张或动脉瘤形成”的影像学特征作为主要诊断指标;而基因检测、血清TGF-β1检测可以作为辅助性诊断方法;肝脏组织病理学活检应当谨慎对待;HHHT为进展性疾病，依据病变程度和发病阶段，病人可以分为无症状型、简单型（肝动脉单支型）和复杂型（肝动脉多支型）三型;早期、积极的个体化治疗具有较好的临床效果;保留肝周韧带及胆道供血的肝动脉结/缩扎手术疗效满意。
　　 意义：
　　 比较系统地总结和分析了HHHT病人的临床特点，在国内率先提出了HHHT的诊断策略和个体化治疗方案;针对单纯肝动脉结扎术后引起肝组织及胆道缺血坏死的风险，创新性地提出了预防性措施和改良术式，即1）严格控制手术适应征，当存在明显门静脉-肝静脉瘘时，避免施行肝动脉结扎术;2）尽量不游离胆管、保留肝周韧带及胆管血供;3）将结扎和缩扎术式结合（即肝动脉结/缩扎术），避免单纯结扎术后肝组织及胆道缺血坏死。
　　 第二部分：环指蛋白11(RNF11)与TGF-β传导通路相关实验研究
　　 目的
　　 探讨环指蛋白11(RingFingerProtein11，RNF11)通过TGF-β通路对ChangLiver肝细胞系增殖的作用，验证RNF11对TGF-β传导通路的正性调控作用。
　　 方法
　　 通过PCR技术检测ChangLiver正常肝细胞系、Hepg-2肝癌细胞系、A549肺腺癌细胞系中RNF11的表达情况;构建并通过SgfI单酶切法、SgfI和MIuI双酶切法以及DNA直接测序法鉴定RNF11真核表达载体pCMV6-RNF11-GFP;应用TGF-β1对ChangLiver细胞增殖的浓度梯度实验标准化TGF-β1的给药浓度;通过脂质体法将pCMV6-RNF11-GFP载体及空载体转染给ChangLiver细胞;转染后24h，给予终浓度5ng/mlTGF-β1处理（由浓度梯度实验确定），在转染后48h、72h、96h（即TGF-β1给药后24h、48h、72h），对转染组、空转组、对照组分别用CCK-8法、Brdu-DAPI复染法及生长曲线描述法检测细胞增殖情况。
　　 结果
　　 1、ChangLiver细胞系表达RNF11;
　　 2、CCK-8法及细胞生长曲线示RNF11转染组细胞增殖趋缓，与相应对照组及空转组相比有显著性差异(P＜0.05);
　　 3、RNF11转染后48、72、96小时ChangLiver细胞增殖抑制率分别为10.80％、14.47％、16.31％，而相对应空转组细胞的增殖抑制率分别为3.52％、4.61％、4.84％;
　　 4、Brdu-DAPI法示转染组Brdu阳性细胞比例明显少于空转组及对照组，具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论
　　 RNF11能增强TGF-β1在ChangLiver细胞增殖过程中的增殖抑制作用，提示其对TGF-β传导通路具有正性调节作用;RNF11可能成为肝脏增生调控的新靶点，对研究肝脏增殖终止阶段TGF-β1及TGF-β通路的作用具有一定意义。
　　 意义
　　 RNF11被认为是细胞信号和转录调节的交叉点，我们通过体外细胞增殖实验验证其对TGF-β信号的正性调节作用。另一方面，遗传性出血性毛细血管扩张症的致病原因为TGF-β通路相关基因突变，导致TGF-β传导通路受阻。针对“单倍剂量不足”的致病机制，增强TGF-β信号的方法或许能起到治疗作用，而RNF11与TGF-β传导通路相关实验研究正是有益的尝试，为下一步应用TGF-β通路相关调节因子调控血管生成及治疗HHHT的实验研究做前期准备。