弓形虫致密颗粒抗原GRA7疫苗初免-加强免疫策略增强小鼠抗弓形虫感染的免疫保护性研究

摘要

弓形虫是一种细胞内寄生的原虫，可感染包括人在内所有温血脊椎动物的有核细胞，引起人兽共患弓形虫病，严重威胁着人类健康和畜牧业生产。目前为止，尚无有效的治疗药物。鉴于疫苗防治多种疾病的经验，研制安全有效的抗弓形虫疫苗不失为一种具有潜力的防治措施。为此，本研究制备了弓形虫致密颗粒抗原GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗，将其接种于BALB/c小鼠，评价疫苗的免疫效果，并观察异质性prime-boost免疫策略对小鼠免疫应答的影响，为研制安全有效的弓形虫疫苗及优化免疫方案奠定基础。
　　 目的:
　　 构建编码弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核表达质粒pEGFP-GRA7和原核表达质粒pET30-GRA7，分别制备弓形虫GRA7的DNA疫苗和蛋白质疫苗，评价疫苗的免疫效果，观察prime-boost免疫策略对小鼠免疫应答的影响。
　　 方法:
　　 采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增弓形虫致密颗粒抗原GRA7基因，回收PCR产物，将其连接至克隆载体pEASY-T1中，构建克隆载体pEASY-GRA7，分别进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。采用亚克隆技术将GRA7基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-C(1)和原核表达载体pET-30a(+)中，分别构建能表达GRA7的重组真核表达载体pEGFP-GRA7和重组原核表达载体pET30-GRA7，并对它们进行鉴定。将pEGFP-GRA7转染HFF细胞，经荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Westernblotting分析、鉴定后，大量提取重组质粒pEGFP-GRA7用于制备弓形虫GRA7DNA疫苗。将pET30-GRA7转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，采用镍柱亲和层析法纯化GRA7蛋白，SDS-PAGE和Westernblotting分析鉴定后，制备弓形虫GRA7重组蛋白疫苗。动物实验观察疫苗的免疫效果，同时评价异质性prime-boost免疫策略对BALB/c小鼠免疫应答的影响。
　　 结果:
　　 经PCR体外扩增获得GRA7基因片段，大小为708bp。重组真核表达质粒pEGFP-GRA7经菌落PCR、双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示在708bp处有一特异性条带，与预期GRA7目的基因片段大小一致;DNA测序结果显示目的基因片段GRA7准确插入真核表达质粒中。pEGFP-GRA7转染的HFF细胞经荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Westernblotting分析，均能检测到GRA7蛋白的表达。重组原核表达质粒pET30-GRA7经菌落PCR、双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示在708bp处有一特异性条带，与预期GRA7目的基因片段大小一致;DNA测序结果显示目的基因片段GRA7准确插入原核表达质粒中。pET30-GRA7转入EcoliBL21诱导产物经SDS-PAGE和Westernblotting分析，可检测到GRA7蛋白的表达。采用异质性prime-boost免疫策略接种BALB/c小鼠，其中DNA疫苗初免-蛋白加强免疫组小鼠抗弓形虫IgG、IgG2a和IFN-γ水平均高于其它实验组(P＜0.05)，而各组间IL-4和IL-10水平差异无显著性。
　　 结论:
　　 体外扩增弓形虫致密颗粒抗原GRA7基因并亚克隆到表达载体中，成功制备了弓形虫GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗。采用DNA疫苗初免-蛋白加强免疫策略可诱导小鼠较强的抗GRA7的体液免疫和细胞免疫，显著增强小鼠抗弓形虫感染的保护作用。