柄海鞘、海胆可培养共附生微生物多样性研究及三株海洋新菌的分类鉴定

摘要

通过纯培养和16SrRNA基因序列的相似性比对，并构建系统发育树对威海海域柄海鞘(Styelaclava)、马粪海胆（Hemicentrotuspulcherrimus）可培养共附生细菌的多样性进行了研究。用2216E培养基从柄海鞘、海胆样品中分别分离到78和113株细菌，通过形态学特征和TCBS培养基选择性筛选后，分别选取30、31株具有代表性的菌株进行了16SrRNA基因测序和基于16SrRNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明，柄海鞘30株细菌分别属于细菌域的4个大的系统发育类群(Actinobacteria，Bacteroidetes，Firmicute，Proteobacteria)的13个科，13个属。其中菌株HQW7、HQYD1、HQWD4、HQE1和HQE2与相关模式菌株的16SrRNA基因相似度较低，初步推断这5株菌可能代表新的分类单元。分离自海胆的31株细菌分别属于细菌域的4个大的系统发育类群(Actinobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes，Proteobacteria)的13个科，14个属。经16SrRNA基因序列分析，菌株HD4、HD13、YD24可能是海洋细菌新种。柄海鞘和马粪海胆共附生细菌中γ变形菌纲的菌是优势菌群，占所分离细菌总数的50％以上。研究表明威海海域柄海鞘、马粪海胆共附生细菌存在着较为丰富的物种多样性和系统发育多样性，并存在新的物种。
　　 在对马粪海胆共附生细菌多样性研究中，基于16SrRNA基因序列分析，发现从海胆体腔液中分离的菌株HD4为需盐杆菌属（Salegentibacter）的细菌新种，通过形态学、生理生化特征研究表明HD4为革兰氏阴性，专性好氧菌，无鞭毛无运动性，在2216E培养基上形成黄色菌落。最适生长条件是:28-30℃，pH7.5-8.3，3-5％(w/v)NaCl。DNA(G+C)mol％含量是37.0％。主要脂肪酸有iso-C15∶0,iso-C17∶03-OH和summedfeature3(iso-C15∶02OH/C16∶1ω7c)。基于以上研究，将HD4命名为海胆需盐杆菌Salegentibacterechinorum。模式菌株是HD4T(=CICC10466T=NRRLB-59666T)。HD4T16SrRNA基因序列的GenBank收录号是JN040280。
　　 以同样的方法对实验室保存菌株J221和H5也进行了分类鉴定。J221是革兰氏阴性、氧化酶阳性、好氧杆菌，有一至几根极生鞭毛，具有运动性。最适生长条件:25-28℃，pH7.5-8.0，2-3％(w/v)NaCl。细胞脂肪酸包括summedfeature3(C16∶1ω7c/C16∶1ω6c)，C16∶0和C18∶1ω7c。基因组DNA(G+C)mol％含量是46.8％。基于16SrRNA基因序列的系统发育分析表明J221属于γ-变形菌纲，但是与目前已发表属的相似性＜91％。因此我们认为J221应该代表一个新属，命名为奈尔菌属Neiella。模式菌种是J221T(=CGMCC1.10130T=NRRLB-51319T)，命名为海洋奈尔杆菌Neiellamarinum。J221T的16SrRNA基因序列的GenBank收录号是EU513001。
　　 H5是革兰氏阳性、无芽孢、不运动的直杆状或略有弯曲的杆状菌。最适生长条件是28-30℃，pH7.5-8.0，0-1％（w/v）NaCl。H5的醌类型是MK-9，MK-9(H2)和MK-9(H4)，脂肪酸是C18∶1ω9c，C16∶0，C14∶0，C18∶0和C16∶1ω9c。细胞壁肽聚糖类型是A5alpha（L-Lys-L-Ala-L-Lys-D-Glu），细胞极性脂有双磷脂酰甘油，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇甘露糖苷。基因组DNA(G+C)mol％含量是61.8％。基于16SrRNA基因序列的相似性分析表明H5属于放线菌科的新属。基于形态学、生理生化和分子特征分析，我们认为H5代表新属—黄色弯曲杆菌属Flaviflexus。模式菌种黄海黄色弯曲杆菌Flaviflexushuanghaiensis是H5T(=DSM24315T=CICC10486T)。其16SrRNA基因序列的GeneBank收录号是JN815236。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 海洋微生物的研究现状

1．2 海洋微生物多样性研究方法

1．2．1 海洋微生物多样性研究的传统方法

1．2．2 分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用

1．3 细菌新物种的分类鉴定

1．3．1 细菌新种的命名

1．3．2 细菌的分类

1．3．3 细菌分类鉴定的方法

1．4 海洋动植物共附生微生物

1．4．1 共附生微生物

1．4．2 柄海鞘、海胆简介

1．5 本论文研究的立项依据

第二章 柄海鞘，海胆可培养共附生细菌多样性研究

引言

2．1 实验材料和方法

2．1．1 培养基及主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 样品处理及菌株分离

2．2．3 菌株的分离纯化与保藏

2．2．4 细菌的培养特征观察

2．2．5 16S rRNA基因序列分析

2．3 结果与分析

2．3．1 细菌的分离及形态特征

2．3．2 柄海鞘可培养微生物类群的多样性

2．3．3 海胆可培养微生物类群的多样性

2．4 讨论

第三章 海洋新菌种——海胆需盐杆菌(Salegentibacter echinarum)HD4的鉴定

引言

3．1 实验材料

3．1．1 材料

3．1．2 实验菌株及来源

3．2 实验方法

3．2．1 菌株HD4的16S rRNA基因序列测定和分析

3．2．2 菌株表型特征鉴定

3．2．3 菌株生理生化鉴定

3．2．4 菌株API快速鉴定

3．2．5 脂肪酸含量分析

3．2．6 DNA(G+C)mol％含量测定

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株HD4形态特征

3．3．2 菌株HD4的生理生化特征

3．3．3 菌株HD4的脂肪酸含量

2．3．4 菌株HD4的DNA(G+C)mol％含量

3．3．5 菌株HD4 16S rRNA基因测序结果及分析

3．4 讨论

第四章 海洋细菌奈尔氏菌属Neiella marinum J221的鉴定

引言

4．1 实验材料

4．1．1 培养基及主要试剂

4．1．2 实验菌株及来源

4．2 实验方法

4．2．1 菌株16S rRNA基因序列测定

4．2．2 菌株形态特征鉴定

4．2．3 菌株的基本生理生化鉴定

4．2．4 API鉴定系统

4．2．5 脂肪酸含量测定

4．2．6 DNA(G+C)mol％含量测定

4．3 结果与分析

4．3．1 菌株J221形态特征

4．3．2 菌株J221的生理生化特征

4．3．3 菌株J221的脂肪酸分析

4．3．4 菌株J221的DNA(G+C)mol％含量

4．3．5 菌株J221 16S rRNA基因测序结果及分析

4．3．6 奈尔氏菌属Neiella新属的描述

4．4 讨论

第五章 海洋放线菌新种黄色弯曲杆菌Flaviflexus huanghaiensis H5的鉴定

引言

5．1 实验材料

5．1．1 培养基及主要试剂

5．1．2 实验菌株及来源

5．2 实验方法

5．2．1 实验菌株16S rDNA鉴定

5．2．2 菌株形态特征鉴定

5．2．3 菌株经典生理生化鉴定

5．2．4 API鉴定系统

5．2．5 脂肪酸含量测定

5．2．6 菌株H5 DNA(G+C)mol％含量测定

5．2．7 醌和极性脂分析

5．3 结果与分析

5．3．1 菌株H5的表型特征

5．3．2 菌株H5生理化特征

5．3．3 菌株H5的脂肪酸含量分析

5．3．4 菌株H5 DNA(G+C)mol％含量分析

5．3．5 菌株H5的醌类型及极性脂分析

5．3．6 菌株H5 16S rDNA测序结果及分析

5．3．7 黄色弯曲杆菌属Flaviflexus新属的描述

5．4 讨论

小结

参考文献

致谢

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