MiR-429在结直肠癌中表达临床意义及其对细胞凋亡影响的研究

摘要

目的:
　　 检测microRNA-429(miR-429)在结直肠癌组织中的表达，评估其表达与结直肠癌患者临床病理参数及预后的关系，并初步探讨其在结直肠癌细胞凋亡中的作用机制。
　　 方法:
　　 1.应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测miR-429在107例结直肠癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达水平，分析其表达与结直肠癌患者临床病理参数及预后的关系。
　　 2.应用脂质体(Lipofectamine)2000瞬时转染的方法，将化学合成的miR-429mimics或miR-negativecontrolmimics转染到结肠癌细胞系HT-29中。然后采用qRT-PCR检测转染前后miR-429的表达，确定转染效率;采用流式细胞术检测转染前后细胞凋亡的变化;采用caspase-3活性测定试剂盒检测转染前后caspase-3活性的改变，并利用Westernblot检测活化caspase-3蛋白的表达水平。
　　 3.应用生物信息学分析软件TargetScan和miRanda预测miR-429的可能靶基因为SOX2;利用荧光素酶报告基因实验，将含有SOX2基因3'端非编码区序列(WT-SOX23'-UTR)或突变序列(MUT-SOX23'-UTR)的荧光素酶报告载体与miR-429mimics或miR-negativecontrolmimics共转染到HT-29细胞系中，检测荧光素酶的活性，验证预测结果。瞬时转染miR-429mimics或miR-negativecontrolmimics，采用qRT-PCR及Westernblot方法检测潜在靶基因SOX2mRNA及蛋白水平的表达改变。采用qRT-PCR方法检测SOX2在107例结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平，分析miR-429与SOX2表达的相关性。
　　 4.应用瞬时转染的方法将miR-429mimics或miR-negativecontrolmimics与PCMV-HA-SOX2质粒共转染到HT-29细胞系中。然后采用流式细胞术检测转染前后细胞凋亡的变化;采用caspase-3活性测定试剂盒检测转染前后caspase-3活性的改变，并利用Westernblot检测活化caspase-3蛋白的表达水平。探讨miR-429影响结直肠癌细胞凋亡的可能作用机制。
　　 结果:
　　 1.qRT-PCR结果显示，与癌旁正常组织比较，miR-429在结直肠癌组织中的表达明显上调，二者相比较有显著的统计学差异(P＜0.0001)，其中，69％(73/107)的患者miR-429表达上调水平大于2倍。
　　 2.MiR-429表达与结直肠癌患者肿瘤大小及淋巴结转移显著相关(P＜0.05)，而与年龄、性别、肿瘤位置、细胞分化程度、浸润深度及临床分期无显著相关性(P＞0.05)。MiR-429高表达患者5年总体生存率显著低于miR-429低表达患者(P=0.002)。Cox回归多因素分析结果显示miR-429高表达是影响结直肠癌患者预后的独立因素(RR:2.165，95％CI:1.015-4.618，P=0.046)。
　　 3.将miR-429mimics或miR-negativecontrolmimics转染HT-29细胞，与转染miR-negativecontrolmimics组相比，miR-429mimics转染组miR-429表达水平显著升高(P＜0.0001);细胞凋亡率显著下降(P＜0.01);caspase-3活性显著减弱(P＜0.01)，同时活化caspase-3蛋白的表达水平也明显降低。
　　 4.生物信息学分析软件TargetScan和miRanda预测结果显示SOX2的3'-UTR区含有可与miR-429互补结合的序列。荧光素酶报告基因实验显示，与对照组相比，共转染miR-429mimics与含WT-SOX23'-UTR的荧光素酶报告载体时，细胞的荧光素酶活性明显下降(P＜0.05)，表明miR-429能够与SOX2的3'-UTR区直接结合。在转染miR-429mimics的结直肠癌细胞中，SOX2mRNA及蛋白表达水平均显著下降。分析qRT-PCR检测结果发现SOX2和miR-429在结直肠癌组织中的表达呈显著负相关(r=-0.292，P=0.002)。
　　 5.与对照组相比，共转染miR-429mimics与PCMV-HA-SOX2质粒组的结直肠癌细胞凋亡率、capase-3活性及活化caspase-3的蛋白表达水平均部分恢复(P＜0.05)。转染PCMV-HA-SOX2质粒组细胞凋亡率、caspase-3活性及活化caspase-3蛋白的表达水平均明显增加(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.MiR-429在结直肠癌组织中表达显著高于癌旁正常组织，与肿瘤大小及淋巴结转移显著相关，并且是影响患者预后的独立因素，提示其可能在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用，并可作为预后标志物，具有潜在的临床应用价值。
　　 2.MiR-429可能通过直接下调SOX2表达，进一步抑制caspase依赖的凋亡途径，从而参与结直肠癌发生发展，为阐明miR-429在结直肠癌发生发展中的具体作用机制提供了新的线索，并为结直肠癌的治疗提供了新的思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)现状

二、MicroRNAs(miRNAs)概况及其与结直肠癌的关系

三、MicroRNA-429(miR-429)与肿瘤的关系

实验材料

一、组织标本

二、细胞来源

三、主要试剂

四、主要试剂配制

五、主要仪器设备

实验方法

一、qRT-PCR方法检测组织标本和细胞系中miR-429及SOX2的表达

二、细胞培养及铺板

三、PCMV-HA-SOX2质粒的提取

四、细胞转染实验

五、Western bolt方法检测细胞中SOX2、caspase-3和cleaved caspase-3的表达

六、预测并验证miR-429靶点

七、流式细胞术检测细胞凋亡

八、Caspase-3活性检测

七、数据处理和统计学分析

结果

一、MiR-429在结直肠癌及癌旁正常对照组织中的表达情况

二、MiR-429在结直肠癌中表达上调的临床意义

三、MiR-429抑制结直肠癌细胞凋亡

四、SOX2是miR-429的直接调节靶基因

五、过表达SOX2能部分消除miR-429的凋亡抑制作用

讨论

结论

附表和附图

参考文献

致谢

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