白蛋白对大鼠肾脏功能及整合素连接激酶、整合素β1和α-辅肌动蛋白-4的影响

摘要

研究背景:
　　 肾脏是人体的重要器官，主要参与机体的排泄以及维持内环境的稳定。慢性肾病已经成为当今社会严重危害人类健康的疾病之一。蛋白尿是慢性肾病进展的独立危险因素，病人一旦出现持续性蛋白尿则病情不可逆转而发展至终末期肾功能衰竭。肾小球是肾脏发挥滤过和排泄功能的主要部位，在某些病理因素的作用下，肾小球的滤过屏障极易受损，导致大分子蛋白质随尿液渗出而形成蛋白尿。肾小球的滤过屏障由毛细血管内皮细胞、基底膜以及足细胞构成，足细胞在肾小球滤过过程中发挥了最关键的作用。肾小球疾病主要的病理学改变为肾小球滤过屏障受损而导致的蛋白尿。研究认为尿蛋白对近端肾小管上皮细胞有直接损害作用，蛋白尿可以通过损伤肾小管来加重肾脏损害和促进慢性肾病的进展。以往的研究表明，足细胞数目及其密度与尿蛋白量呈显著负相关，肾病患者临床表现为蛋白尿时均伴有足细胞数目及密度的减少，其中以大量蛋白尿最为显著，但其机制尚未清楚。
　　 Integrinα3β1是足细胞贴近GBM侧的跨膜蛋白，在维持足细胞与GBM之间的粘附和足细胞内外跨膜信号传导方面发挥了重要作用。Integrinα3β1不仅可以通过与GBM上的配体直接结合，将足细胞牢牢地锚定在基底膜上;还可以通过与细胞骨架直接连接维持足突的形态，调节细胞骨架的动力学。一方面，ILK通过C端与integrinβ1相连，直接参与和调节整合素通路的相关过程;另一方面，ILK还可以通过N端与α-actinin-4及细胞骨架相连，参与整合素和α-actinin-4介导的细胞骨架动力学过程。α-Actinin-4是足细胞上特异表达的细胞骨架辅肌动蛋白，能够与F-actin直接连接，在维持足突结构方面尤为重要。白蛋白是蛋白尿的主要成分，因此，本实验选取ILK、integrinβ1和α-actinin-4作为目的蛋白，研究白蛋白超负荷大鼠肾脏功能的改变及肾脏总ILK、integrinβ1和α-actinin-4的表达情况。此外，我们通过体外足细胞白蛋白超负荷模型观测在大量白蛋白的刺激下足细胞中ILK、integrinβ1和α-actinin-4的表达情况。为深入探讨足细胞的损伤机制提供理论依据，对慢性肾病的早期防治具有重要意义。
　　 实验方法:
　　 一、白蛋白对大鼠肾脏功能及ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影响
　　 模型组大鼠每天每只腹腔注射2g白蛋白，对照组大鼠每天每只腹腔注射等体积生理盐水。收集白蛋白注射后第1、3、7、13天的尿液，第14天处死大鼠，取肾脏和血液用于后续试验。
　　 1.白蛋白对大鼠肾脏功能的影响。
　　 记录大鼠体重和尿量，测定尿总蛋白和尿肌酐;取左肾组织进行常规石蜡切片，HE染色，观察肾脏组织形态;透射电镜观察足细胞形态;取血测定血肌酐、称量右肾重量。
　　 2.白蛋白对大鼠肾脏总ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影响
　　 采用westernblot和免疫组织化学染色法观察白蛋白对大鼠肾总ILK、integrinβ1和α-actinin-4蛋白表达的影响;采用RT-PCR法观察白蛋白对大鼠肾总ILK、integrinβ1和α-actinin-4mRNA表达的影响。
　　 二、白蛋白对足细胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影响
　　 实验前将分化成熟的足细胞(MP5)在1％FCS中过夜，以BSA的终浓度0、5、10、20mg/mL孵育12、24、48h。Westernblot和免疫荧光法检测白蛋白对足细胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4蛋白表达的影响;实时定量PCR法检测白蛋白对足细胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4mRNA表达的影响。
　　 实验结果:
　　 一、白蛋白对大鼠肾脏功能及ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影响
　　 1.白蛋白对大鼠肾脏功能的影响。
　　 白蛋白注射第3天24h尿总蛋白急剧升高并达到最高峰，第7天至第13天均维持着较高的水平;白蛋白组尿量低于对照组且呈深黄色;HE染色结果发现白蛋白注射组肾小球内有细胞融合发生，肾小管管腔上皮细胞破损;电镜照片显示白蛋白注射组足突发生明显融合，有部分GBM裸露。
　　 2.白蛋白对大鼠肾脏总ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影响
　　 Westernblot和免疫组织化学染色结果表明白蛋白组大鼠肾总ILK和α-actinin-4蛋白的表达水平高于对照组，而integrinβ1蛋白的表达水平低于对照组;RT-PCR结果表明白蛋白组大鼠肾总ILK和α-actinin-4mRNA的表达水平高于对照组，而白蛋白组大鼠肾总integrinβ1mRNA的表达水平低于对照组。
　　 二、白蛋白对小鼠足细胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影响
　　 足细胞与白蛋白作用一段时间后，ILK与α-actinin-4的蛋白水平和mRNA水平显著升高，并且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。Integrinβ1的蛋白表达呈一定浓度依赖性和时间依赖性的减少;高浓度的白蛋白可以先增加再降低integrinβ1的mRNA的表达，随着白蛋白与足细胞作用时间的延长，integrinβ1的mRNA先升高再降低。
　　 实验结论:
　　 1.白蛋白超负荷可以引起肾脏功能的紊乱，出现蛋白尿、少尿、肌酐清除率降低、肾脏指数增加等表现，进而引起肾脏损伤。
　　 2.白蛋白对肾脏造成损伤的机制可能与足细胞异常表达ILK、integrinβ1和α-actinin-4有关。