USP4通过去泛素化RIg-I正向调节其介导的抗病毒作用

摘要

Ⅰ型干扰素（IFN-α/β）具有较强的抗病毒活性，并在机体对抗病毒感染中发挥举足轻重的作用。病毒感染机体后，其保守的病原相关分子模式可被Toll样受体(Tolllikereceptors，TLRs)、维甲酸诱导基因Ⅰ受体(RIG-Ⅰ-likereceptors，RLRs)等模式识别受体(Pattern-recognitionreceptors，PRRs)所识别，通过一系列信号转导，最终激活免疫细胞释放Ⅰ型干扰素及促炎症细胞因子，从而发挥抗病毒作用。
　　 蛋白的泛素化作用在RIG-Ⅰ受体的活化和抗病毒免疫反应中起着至关重要的调节作用。然而，与RIG-Ⅰ活化相关的去泛素化作用的功能尚不明确。我们研究发现，泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specificprotease4，USP4)可以通过其去泛素化酶活性来调节RIG-Ⅰ的表达和活化。病毒感染诱导RIG-Ⅰ激活后，USP4的表达明显降低。而USP4的过表达能够显著增强RIG-Ⅰ的表达并上调其活化诱导的IFN-β的释放，同时抑制水泡口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus，VSV)的复制增殖。而用siRNA干扰USP4表达后会得到相反的结果。另外，USP4可以与RIG-Ⅰ直接相互作用并特异性去除其K48偶联的泛素链。
　　 因此，我们提出，USP4作为RIG-Ⅰ的一个新的调节分子，通过其去泛素化酶活性去除RIG-ⅠK48偶联的泛素链来稳定RIG-Ⅰ的表达，从而正向调节其下游信号通路。
　　 研究目的:
　　 1、阐明USP4在RIG-Ⅰ信号通路中的功能;
　　 2、找出USP4的作用靶点及机制;
　　 3、探讨USP4在细胞抗病毒反应中的作用。
　　 研究方法:
　　 1、在不同细胞中检测RIG-Ⅰ的活化对USP4的表达的影响。
　　 1.1、在Hela细胞中检测RIG-Ⅰ活化对USP4表达的影响。
　　 a.Ⅰ在Hela细胞中转染ply((I)∶C)0，2，4，8，12h，RT-PCR检测USP4的表达（mRNA水平）;
　　 Ⅱ在Hela细胞中转染poly((I)∶C)0，12，24，36h，Westernblot检测USP4的表达（蛋白水平）。
　　 b.Ⅰ用SeV（Sendaivirus，仙台病毒）刺激Hela细胞0，8，12，24h，RT-PCR检测USP4的表达(mRNA水平);
　　 Ⅱ用SeV刺激Hela细胞0，8，12，24，36h，Westernblot检测USP4的表达（蛋白水平）。
　　 1.2在小鼠原代腹腔巨噬细胞中检测RIG-Ⅰ活化对USP4表达的影响。提取小鼠原代腹腔巨噬细胞，(
　　 )ⅠSeV刺激0，4，8，12，24h，RT-PCR检测USP4的表达(mRNA水平);(
　　 )ⅡSeV刺激0，12，24，36h，Westernblot检测USP4的表达（蛋白水平）。
　　 2、表达变化的USP4对RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达的影响。
　　 2.1mRNA水平检测表达变化的USP4对RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达的影响。
　　 a.在HEK293细胞中分别转染空白质粒或USP4的高表达质粒24h后，再分别转染poly((I)∶C)或poly(dA∶dT)12h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 b.Ⅰ在HEK293或Hela细胞中分别转染CtrlsiRNA或USP4siRNA36h后，再转染poly((I)∶C)0，4h，8h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 Ⅱ在HEK293或Hela细胞中分别转染CtrlsiRNA或USP4siRNA36h后，再转染poly(dA∶dT)0，16h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 Ⅲ在Hela细胞中分别转染CtrlsiRNA或USP4siRNA36h后，SeV刺激0，12h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 2.2检测表达变化的USP4对RIG-Ⅰ介导的IFN-β和IRF3报告基因活性的影响。
　　 a.在Hela细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和IFN-β、IRF3的报告基因质粒，SeV刺激12h后检测报告基因活性差异。
　　 b.在Hela细胞中分别转染CtrlsiRNA或USP4siRNA，再分别转染IFN-β、IRF3的报告基因质粒，SeV刺激12h后检测报告基因活性差异。
　　 3、确定USP4的作用靶点。
　　 3.1mRNA水平检测表达变化的USP4对RIG-Ⅰ信号通路中各接头分子介导的IFN-β表达的影响。
　　 a.在HEK293细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和RIG-Ⅰ，MAVS，TBK1，IRF35D，TRIF，IKK-ε，MDA5的表达质粒24h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 b.在HEK293细胞中分别转染CtrlsiRNA或USP4siRNA24h后，再分别转染RIG-Ⅰ，MAVS，TBK1，IRF35D，MDA5的表达质粒24h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 c.在Huh7.5细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和RIG-Ⅰ，MAVS，TBK1，IRF35D的表达质粒24h，RT-PCR检测IFN-β的表达。
　　 3.2检测USP4高表达对RIG-Ⅰ信号通路中各接头分子介导的IFN-β和IRF3报告基因活性的影响。
　　 在HEK293细胞中分别共转染空白质粒或USP4的高表达质粒和TRIF，RIG-Ⅰ，MAVS，TBK1，IRF35D的表达质粒与IFN-β、IRF3的报告基因质粒，24h后检测报告基因活性差异。
　　 3.3蛋白水平检测表达变化的USP4对各接头分子表达的影响。
　　 a.在HEK293细胞中分别共转染不同剂量的空白质粒或USP4的高表达质粒和RIG-Ⅰ，MAVS，STING,TBK1，IRF3，IKK-ε，MDA5的表达质粒，WesternBlot检测各接头分子的表达情况。
　　 b.在Hela细胞中分别转染CtrlsiRNA或USP4siRNA36h，WesternBlot检测内源性的RIG-Ⅰ，MAVS和TBK1的表达情况。
　　 4、USP4调控RIG-Ⅰ信号通路的分子机制研究。
　　 4.1根据前面的结果，免疫共沉淀明确USP4与RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1等相关靶分子的结合情况。
　　 a.在HEK293细胞中分别共转染带有Myc标签的USP4质粒和带有Flag标签的RIG-Ⅰ、MAVS等质粒，分别用相应抗体进行免疫沉淀检测其相互结合情况。
　　 b.在Hela细胞中转染poly((I)∶C)0，8，12h，免疫沉淀结合WesternBlot检测内源性的USP4与RIG-Ⅰ、MAVS等信号分子的结合情况。
　　 c.在HEK293细胞中分别共转染USP4各节段质粒和RIG-Ⅰ、MAVS等质粒，免疫共沉淀检测各节段与靶分子的结合情况，明确USP4与靶分子结合的结构域。
　　 4.2USP4对相应靶分子泛素化的影响。
　　 a.靶分子表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒共转染HEK293细胞，免疫共沉淀结合WesternBlot检测USP4对靶分子泛素化的影响。
　　 b.靶分子表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒野生型或突变体（K48突变体、K63突变体）共转染HEK293细胞，免疫共沉淀结合WesternBlot检测USP4对靶分子泛素化形式（K48或K63）的影响。
　　 c.在HEK293细胞中分别共转染CtrlsiRNA或USP4siRNA后，再共转染靶分子表达质粒和泛素质粒野生型或突变体（K48突变体、K63突变体），免疫共沉淀结合WesternBlot检测USP4对靶分子泛素化形式(K48或K63)的影响。
　　 d.在Hela细胞中分别共转染CtrlsiRNA或USP4siRNA，SeV刺激4h后，免疫共沉淀结合WesternBlot检测USP4对内源性靶分子泛素化的影响，同时明确泛素化形式（K48或K63）。
　　 5、USP4在抗病毒感染中的功能研究。
　　 a.在HEK293细胞中分别转染空白质粒或USP4的高表达质粒24h后，用VSV感染细胞，检测VSV的复制情况。(空斑形成实验检测病毒滴度;实时定量PCR检测细胞中VSVmRNA)
　　 b.在HEK293细胞中分别共转染CtrlsiRNA或USP4siRNA48h后，用VSV感染细胞，检测VSV的复制情况。（空斑形成实验检测病毒滴度;实时定量PCR检测细胞中VSVmRNA)
　　 研究结果:
　　 1、RIG-Ⅰ信号通路的活化能够抑制USP4的表达。
　　 a.用poly((I)∶C)转染或SeV刺激Hela细胞以激活RIG-Ⅰ信号通路后，USP4的表达被明显抑制(mRNA水平和蛋白水平)。
　　 b.用SeV刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞，USP4的表达也明显降低(mRNA水平和蛋白水平)。
　　 2、USP4可以显著增强RIG-Ⅰ介导的IFN-β的表达。
　　 a.在HEK293细胞中转染USP4的高表达质粒后，转染poly((I)∶C)或poly(dA∶dT)（活化RIG-Ⅰ信号通路）诱导的IFN-β表达明显上调。
　　 b.特异性小干扰RNA抑制HEK293细胞或Hela细胞中内源性USP4的表达，转染poly((I)∶C)或poly(dA∶dT)诱导的IFN-β表达被明显抑制。
　　 c.特异性小干扰RNA抑制Hela细胞中内源性USP4的表达，可显著抑制SeV诱导的IFN-β的表达。
　　 d.在Hela细胞中，USP4的高表达可明显增强SeV介导的IFN-β和IRF3报告基因的活化;特异性小干扰RNA抑制USP4的表达后，SeV介导的IFN-β和IRF3报告基因活化被显著抑制。
　　 3、USP4靶向作用于RIG-Ⅰ.
　　 3.1USP4特异性调控RlG-Ⅰ介导的IFN-β表达(mRNA水平)。
　　 a.USP4的过表达可明显增强HEK293细胞中RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达（mRNA水平），而对其下游信号分子MAVS，STING,TBK1和接头蛋白MDA5介导的IFN-β的表达无明显影响。在RIG-Ⅰ缺陷的Huh7.5细胞中结果类似。
　　 b.特异性小干扰RNA抑制HEK293细胞中内源性USP4的表达，可显著抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β表达(mRNA水平)，但对其下游信号分子MAVS，STING,TBK1，IRF3，IKK-ε和接头蛋白MDA5介导的IFN-β的表达作用不大。
　　 3.2USP4特异性调控RIG-Ⅰ介导IFN-β及IRF3的报告基因活化。
　　 USP4的过表达可明显增强HEK293细胞中RIG-Ⅰ介导的IFN-β及IRF3的报告基因活化，而对其下游信号分子MAVS，TBK1，IRF3及接头分子TRIF介导的IFN-β及IRF3的报告基因活化无明显作用。
　　 3.3USP4特异性增强RIG-Ⅰ的表达。
　　 a.在HEK293细胞中，USP4的过表达能够显著上调外源性RIG-Ⅰ的表达，且具有剂量依赖性;而对于外源性MAVS，STING,TBK1，IRF3，IKK-ε，MDA5的表达无明显影响。
　　 b.特异性小干扰RNA抑制Hela细胞中内源性USP4的表达，可显著抑制内源性RIG-Ⅰ的表达，而对内源性MAVS，TBK1的表达无明显作用。
　　 4.USP4可以特异性与RIG-Ⅰ相结合。
　　 4.1USP4可以与RIG-Ⅰ相互结合。
　　 a.在HEK293细胞中共转染带有不同标签的USP4和RIG-Ⅰ的表达质粒，分别用相应抗体进行免疫共沉淀，WesternBlot的结果显示，外源性的USP4和RIG-Ⅰ可以相互结合。
　　 b.在Hela细胞中，转染poly((I)∶C)不同的时间点后，用内源性的抗体进行免疫共沉淀，WesternBlot的结果显示，内源性的USP4和RIG-Ⅰ能够组成性结合。
　　 4.2USP4特异性结合于RIG-Ⅰ的N末端Card结构域。
　　 在HEK293细胞中分别共转染空白质粒或USP4表达质粒与RIG-Ⅰ仅有N末端两个Card结构域的质粒RIG-IN，WesternBlot的结果显示，USP4的过表达可以显著增强RIG-IN的表达;免疫共沉淀结果表明，USP4可以直接与RIG-IN相结合。
　　 4.3USP4与RIG-Ⅰ的结合位点位于其N末端的DUSP结构域。
　　 在HEK293细胞中分别共转染USP4的不同节段质粒（WT，野生型;N260，C末端USP结构域缺失;C261，N末端DUSP结构域缺失）与RIG-Ⅰ表达质粒，免疫共沉淀结果表明，RIG-Ⅰ与WT，N260可以相结合，但是与C261未检测到结合。
　　 5.USP4可以特异性移除RIG-Ⅰ的K48-偶联的泛素链。
　　 5.1USP4的过表达可特异性下调RIG-ⅠK48-偶联的体外泛素化作用。
　　 a.RIG-Ⅰ表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒共转染HEK293细胞，免疫共沉淀结果表明，USP4过表达能明显下调RIG-Ⅰ的体外泛素化作用。
　　 b.RIG-Ⅰ表达质粒、USP4表达质粒或空白质粒分别与泛素质粒野生型或突变体(K48突变体、K63突变体)共转染HEK293细胞，免疫共沉淀结果显示，USP4过表达可特异性下调RIG-Ⅰ的K48偶联的泛素化。同时，USP4对于MAVS的体外泛素化作用无明显影响。
　　 5.2特异性小干扰RNA抑制HEK293细胞中内源性USP4的表达，可显著上调RIG-ⅠK48-偶联的体外泛素化作用。
　　 a.在HEK293细胞中分别共转染CtrlsiRNA或USP4siRNA后，再共转染RIG-Ⅰ表达质粒和泛素质粒野生型或突变体(K48突变体、K63突变体)，免疫共沉淀结果显示，USP4的低表达能特异性增强RIG-ⅠK48-偶联的体外泛素化作用。
　　 b.小干扰RNA抑制Hela细胞中内源性USP4的表达，可显著上调SeV刺激诱导的RIG-Ⅰ内源性泛素化作用，同时其K48-偶联的泛素化作用也明显增强。
　　 6.USP4参与细胞抗病毒反应。
　　 USP4的过表达能明显抑制VSV病毒在HEK293细胞中的复制;而用小干扰RNA抑制内源性USP4的表达后能显著促进VSV病毒在胞内的复制。
　　 结论:
　　 1、RIG-Ⅰ信号通路的活化能够抑制USP4的表达。
　　 2、USP4能特异性增强RIG-Ⅰ介导的IFN-β的表达。
　　 3、USP4可以与RIG-Ⅰ相结合并通过去泛素化酶活性去除其K48-偶联的泛素链来稳定RIG-Ⅰ的表达，从而正向调节其下游信号通路。
　　 4、USP4参与细胞抗病毒反应。
　　 创新点及意义:
　　 1、本研究首次提出，USP4作为RIG-Ⅰ的一个新的调节分子，通过其去泛素化酶活性去除RIG-ⅠK48偶联的泛素链来稳定RIG-Ⅰ的表达，从而正向调节其下游信号通路。
　　 2、本研究为正向调控RLR信号通路提供新的实验证据，为抗病毒研究、诊断和治疗提供新的思路。

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结论

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