TLR2与TLR4配体预处理对角膜基质细胞抗烟曲霉菌炎症反应的影响

摘要

研究背景:真菌性角膜炎是一种致盲率极高的感染性角膜病变，我国属与该疾病高发区域，相关的临床流行病学调查显示其发病率逐年上升，因此，防治真菌性角膜炎成为我国致盲性眼科疾病的重要临床课题。
　　 真菌性角膜炎致盲的重要原因之一就是真菌感染后，固有免疫所致的过度炎症反应。随着研究的深入，Toll样受体家族在角膜防御真菌感染过程中发挥的重要作用逐渐为人发现并重视。TLR2在与TLR4在抗真菌免疫应答中占有着重要地位，TLR2可识别酵母聚糖，TLR4可识别脂多糖。随后的研究指出以低浓度TLRs配体预处理诱导细胞，可以使其对再次“致死性”刺激反应性下降和炎性细胞因子分泌减少，该现象曾被称为“TLR耐受”。TLR预处理抑制多形核白细胞过度炎症反应的研究已有较多报道，但其在角膜细胞抗过度炎症反应的研究中较少，不同TLR配体协同耐受的研究更是鲜有报道。
　　 目的:研究酵母聚糖（Zymosan，TLR2特异性配体）单独预处理或与脂多糖（LPS，TLR4特异性配体）联合预处理，对角膜基质细胞抗烟曲霉菌炎症反应的影响。
　　 方法:培养人永生化角膜基质纤维细胞(telomerase-immortatizedhumancorneastromafibroblast，THSF)，以4×105个细胞／孔的浓度接种于6孔板，以不同浓度Zymosan(104ng/ml、103ng/ml、100ng/ml、10ng/ml)预处理角膜基质细胞12h，然后给予大剂量烟曲霉菌刺激4h，收取细胞，通过RT-PCR分析比较不同浓度Zymosan预处理对角膜基质细胞炎性因子(TNF-α，IL-6)表达的影响。以4×105个细胞／孔的浓度将永生化角膜基质细胞接种于6孔板，给与不同浓度Zymosan与LPS(103ng/mlZymosan+10ng/mlLPS、100ng/mlZymosan+10ng/mlLPS)联合预处理，分别在预处理6h，12h，18h，24h，30h后，给予大剂量烟曲霉菌刺激4h，收取6孔板中的细胞上清，通过RT-PCR检测角膜基质细胞炎性因子（TNF-α，IL-6和IL-8）基因水平表达;收取基质细胞，通过ELISA检测培养液上清中炎性因子蛋白的分泌量，分析Zymosan与LPS联合预处理对角膜基质细胞炎症反应的影响。采用SPSS13.0统计软件对数据分析，以均数士标准差表示，采用独立样本t检验与ANOVA分析比较各组间差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:1.1000ng/mlZymosan最大程度的抑制了TNF-α和IL-6的分泌。在一定浓度范围内，Zymosan预处理浓度愈高，对角膜基质炎性细胞因子分泌的抑制愈强。
　　 2.100ng/mlZymosan+10ng/mlLPS联合预处理较二者单独预处理更有效地抑制炎症因子的分泌。
　　 结论:适宜浓度的TLR2配体的预处理可以抑制烟曲霉菌刺激导致的角膜基质细胞炎症因子的过度分泌，适宜浓度的TLR2与TLR4特异配体联合预处理可以更有效地抑制炎性因子的过度分泌。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一、主要实验材料与器材

二 方法

结果

(一)Zymosan对THSFs表达炎性细胞因子的影响

(二)Zymosan与LPS联合预处理抑制大剂量AF诱导THSFs的炎性细胞因子的表达与分泌

(三)Zymosan+LPS联合预处理与Zymosan、LPS单独预处理对细胞炎性因子表达和分泌影响的对比

讨论

结论

附图

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文