β-NGF siRNA对大鼠子宫内膜异位症病灶神经纤维的影响

摘要

背景：
　　 子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)是一种慢性良性的雌激素依赖性的多因素妇科疾病，同时伴有慢性痛经等一系列盆腔疼痛，经前期盆腹腔疼痛，背痛，排尿困难，大便疼痛，性交困难等症状。子宫内膜异位症相关性疼痛可由腹膜炎症，粘连形成和子宫内膜异位症病灶的特异性神经纤维支配引起，与深部浸润疾病的存在相关。研究者发现在子宫内膜异位症患者的异位病灶上有神经纤维的出现。同时，一些报告显示在子宫内膜异位症的异位和在位内膜上神经生长因子NGF（Nerve Growth Factor, NGF）表达增加。NGF最初被认为是一种刺激外周交感和感觉神经元生长和分化的多肽，但在过去的几十年，这种生长因子被证明在多种非神经元类型细胞中表达，且表现出与神经系统发展无关的其它生物效能。首先，NGF是一种疼痛介质，能诱导涉及调节中枢性疼痛传递的抗P物质(Substance P，SP)和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)的神经肽的表达。其次，NGF能增加感觉神经元的数目，而且选择性的营养参与调节疼痛感觉的小纤维感觉神经元和交感神经节神经元。缺乏NGF或者其特异性受体即抗NGF高亲和性受体(Tyrosine kinase receptor-A，TrkA)基因的转基因动物先天性无小直径感受伤害的感觉神经元和痛觉迟钝。相比之下，过度表达NGF的动物则行为性痛觉过敏。
　　 EMs被认为是一种伴有细胞和体液免疫紊乱的慢性炎性疾病。患者腹腔液的高浓度细胞因子和前列腺素能增强对神经纤维的疼痛刺激。促炎细胞因子已经被证明有助于炎性疼痛的发展和痛觉过敏，可能与EMs的病理生理学有关。相反，子宫内膜异位病灶能产生炎性和疼痛介质，包括前列腺素F，缓激肽，转化生长因子b1，其可诱导对神经纤维的局部疼痛刺激。在炎性组织中，NGF的水平增加。
　　 在此项研究中，我们把特异性β-NGF小干扰RNA(β-nerve growth factorsmall interfering RNA,β-NGF siRNA)运用到手术诱导的EMs大鼠里，旨在进一步探讨siRNA对EMs神经纤维的影响和发病机制。
　　 目的：
　　 探讨特异性β-NGF siRNA的沉默对EMs异位病灶生长，全身性痛觉过敏和神经纤维密度的影响。
　　 方法：：
　　 将体质量180～210g成年雌性Wistar大鼠，通过手术成功被诱导为EMs模型。将模型鼠随机分为两组，各12只，即治疗组和对照组。通过蛋白免疫印记分析(Western blot)四种特异性siRNA被检测，最有效应的siRNA通过基因转移被转移到治疗组大鼠。同时，对照组以相同方式转入空质粒。在基因转入前和后，两组存活的每一个异位病灶的长×宽×高被测量。基因转移后两周，收集异位灶。在所有大鼠被杀之前进行鼠尾实验检测。标本切片和用多种抗神经纤维抗体进行免疫组化染色。收集两组的血清和腹腔冲洗液的上清液进行酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分析。
　　 结果
　　 1.运用Western blot方法从四组特异性siRNAs质粒中筛选出最有效应的特异性siRNA质粒.最具有干扰效应的特异性β-NGF siRNA是Group3(F=26.12;P＜0.001)。
　　 2.基因枪转移之前的实验组和对照组的初始体积无明显差异(P＞0.05)，而在转移之后两组之间有统计学差异(P＜0.05)。治疗组和实验组的甩尾潜伏期相比有统计学差异(P＜0.05)。
　　 3.ELISA分析结果显示实验组血清和腹腔冲洗液中的β-NGF浓度低于对照组(P＜0.05)。
　　 4.经过β-NGF siRNA干扰治疗存在有更少的交感和感觉神经纤维(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 基因转移后的特异性siRNA介导的β-NGF基因表达的沉默能抑制EMs异位病灶的生长，改善全身性痛觉过敏以及降低交感和感觉神经纤维密度。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．材料

2．方法

结果

1．Western blot结果

2．模型大鼠异位灶体积和甩尾潜伏期结果

3．基因转移后的β-NGF的分泌

讨论

结论

图表

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

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