表观遗传调控对胰岛β细胞发育和功能以及糖尿病发病的影响和机制

摘要

背景:糖尿病是一种以血糖升高为特点的慢性代谢性疾病，典型的症状:多尿，多饮，以及多食;因其糖脂代谢紊乱，患并发症如动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变、慢性糖尿病肾病以及糖尿病足等的风险极大地增加。糖尿病的病因为胰岛β细胞不能产生足量的胰岛素、组织细胞对胰岛素失去正常的反应或者是二者皆有。目前认为糖尿病是由基因和环境因素共同作用的结果，但糖尿病发病的病因仍然未知。糖尿病主要有Ⅰ型和Ⅱ型两种。Ⅰ型糖尿病与自身免疫攻击破坏和先天易感因素导致β细胞的丢失，胰岛β细胞的缺乏导致产生的胰岛素量不足为主要特点。在这一过程中，许多基因与其发生有关，因此探寻糖尿病相关基因的调控机制对于发现治疗糖尿病的办法有重大意义。
　　 表观遗传是在不改变DNA序列的情况下改变基因的表达水平。目前发现有如下几种表观遗传分子机制:DNA甲基化，RNA干扰，组蛋白乙酰化和组蛋白修饰。小分子RNA是长度为21-25个核苷酸的非编码单链RNA分子，它能通过目标信使RNA3'非翻译区错配来抑制目的基因信使RNA的翻译从而调控基因的表达。小分子RNA有组织特异性并能在细胞功能中起重要作用。目前已有几种小分子RNA被证明会特异性调节胰岛β细胞的发育和功能。组蛋白通过和DNA结合形成核小体，后者组成包含整个基因组的染色质。组蛋白去乙酰酶(HDACs)能使组蛋白去乙酰化，使其和DNA的结合更加紧密，从而抑制基因转录，进而在包括胰岛素信号传递等多个生理过程中发挥重要作用。HDACs抑制剂也被证实可以在炎症过程中防止细胞因子对β细胞的破坏。但是目前HDACs以及HDACs抑制剂对β细胞的直接作用及作用机制仍然未知。本研究从体内体外两部分实验，验证HDAC抑制剂曲古霉素A(TSA)对β细胞的直接作用以及miRNA表达的变化，构建不同miRNA敲除老鼠观察其对链尿佐菌素(STZ)诱发的糖尿病的敏感度，构建HDAC3胰岛β细胞特异敲除的老鼠研究HDAC3对胰岛β细胞发育以及功能的影响。希望从中明确HDAC与胰岛细胞以及糖尿病发生的关系，为开发糖尿病治疗药物提供理论基础。
　　 研究方法:
　　 1，本研究首先采取不同剂量TSA处理小鼠β细胞株mouse insulinoma(MIN6)不同时间，通过MTT检测和流式细胞仪来观察细胞增殖和凋亡的变化，应用micreRNA array技术确定TSA诱导的β细胞micreRNA表达谱的变化，预测改变的micreRNAs和β细胞凋亡信号因子调节关系。
　　 2，构建miRNA155系统性敲除以及Tie2-Dicerfl/fl特异性敲除的小鼠，观察它们对多次小剂量STZ诱导糖尿病的敏感度，进而明确miRNA155，以及总miRNA在骨髓源细胞的缺失在炎症介导糖尿病中的作用。
　　 3，为明确HDAC3对β细胞发生发育和功能的作用，构建胰岛β细胞特异敲除HDAC3的小鼠，监测小鼠体重血糖水平的变化，通过糖耐量实验和葡萄糖刺激的胰岛素分泌来检测小鼠胰岛功能，利用组织学分析和免疫荧光染色来确定其胰岛体积变化和胰岛β细胞的增殖状态，多次小剂量STZ注射观察他们对炎症介导糖尿病的敏感度。通过体外的siRNA敲除HDAC3，实时定量PCR检测胰岛素相关基因以及HDAC3潜在靶点基因转录水平，发现细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)为HDAC3可能的作用靶点，通过双敲除HDAC3和SOCS3验证相关基因表达以及对胰岛素含量和释放的影响。
　　 结果:
　　 1，TSA对MIN6细胞活性有明显的抑制作用，且有明显的时间剂量效应关系，TAS能显著提高MIN6细胞凋亡水平，分别有61和56个miRNA表达下调和上调(|-△△Ct|≥1)，其中12个上调的和25个下调的miRNA可以特异调控β细胞凋亡通路的信号因子。
　　 2，miRNA155系统性敲除的小鼠在多次小剂量STZ诱导的糖尿病中发病率和野生型小鼠没有明显区别，但是骨髓源细胞特异Dicer敲除小鼠却呈现出了明显的低发病率。
　　 3，胰岛β细胞特异性敲除HDAC3小鼠体重较同窝对照小鼠比体重明显降低，血糖值明显升高，且有一定早期自发糖尿病概率，糖耐量实验证实了其葡萄糖不耐受且有胰岛素分泌障碍，组织学证明其胰岛体积并未明显减少，但是其胰腺胰岛素含量以及其处于增生状态的β细胞比例都显著降低，多次小剂量STZ诱导的糖尿病发病率远高于对照组小鼠。体外通过siRNA敲除HDAC3使MIN6细胞胰岛素基因转录水平明显下降，通过筛查控制胰岛素合成和分泌以及β细胞增生发育的相关基因，SOCS3被认为是潜在靶点，CHIP证明了HDAC3和SOCS3启动子的结合，通过HDAC3和SOCS3双敲除证明了SOCS3可以或者是部分的改善HDAC3敲除对β细胞胰岛素合成分泌的抑制作用。
　　 结论:
　　 1，HDAC抑制剂对胰岛β细胞有明显生长抑制和促凋亡作用，伴随着多种miRNAs表达的变化，TSA很可能通过miRNA的参与介导了β细胞的凋亡过程，作为目前一种有前途的抗癌药物，TSA对β细胞的负面作用不可忽视，
　　 2，MiRNA155敲除小鼠虽然在别的自身免疫疾病上表现出一定的保护作用，但是却不能降低多次小剂量STZ诱导的糖尿病发生率，说明miRNA在不同的组织和器官炎症活动中有不同作用，骨髓源性细胞通过敲除Dicer导致的miRNA缺失会降低STZ诱导的糖尿病发生率，说明了miRNA对参与胰岛炎症活动的免疫细胞功能必不可少的调节作用。
　　 3，HDAC3敲除会影响β细胞的发育和功能，而且不同于HDACs抑制剂会降低细胞因子介导的胰岛炎症反应，HDAC3的敲除会增加STZ诱导的糖尿病发病率，体外实验也证明了HDAC3沉默会降低胰岛素基因的转录水平以及胰岛素含量，这种作用很可能是通过HDAC3的沉默上调SOCS3来实现的。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 特异性敲除胰腺β细胞HDAC3模型小鼠的糖代谢变化及其机制的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究的创新点及局限性

参考文献

第二部分 HDAC抑制剂对胰岛β细胞microRNA表达和凋亡的的作用研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 骨髓源细胞Dicer敲除能阻止STZ诱导的小鼠自身免疫糖尿病而系统性敲除miR-155却无此作用

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

本研究的创新点及局限性

参考文献

致谢

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