抑癌基因Numb在恶性胸膜间皮瘤中表达的临床意义及其功能研究

摘要

研究背景和目的：
　　 恶性胸膜间皮瘤(malignantpleuralmesothelioma，MPM)是一种少见的胸膜部侵袭性肿瘤，预后极差。它的发病通常与接触石棉有关，尽管自19世纪70年代以来石棉的使用广受限制，但接触后的长期潜伏期使间皮瘤的发病率正持续上升。预计在2010-2020年间，工业发达国家恶性间皮瘤的死亡率将达到高峰。根据组织形态学分类，MPM可分为上皮型、肉瘤样型（纤维型）和混合型三种类型，以上皮型多见。本病传统治疗效果差，确诊后中位生存期约为10-12个月。因此，对MPM有效的诊疗措施亟待研究。近些年来，基因靶向治疗在肿瘤领域的成功应用为MPM寻求有效的治疗方法奠定了基础。
　　 Numb是生物体内最重要的细胞命运决定因子之一，被认为参与多种恶性肿瘤的形成，被认为是颇具希望的抑癌基因。Numb是一种膜相关蛋白，其结构包含一个磷酸酪氨酸结合域(phosphotyrosinebinding，PTB)和一个富脯氨酸域(prolinerichregion，PRR);靠近氨基端的PTB域是Numb作用的关键部位，可与E3泛素连接酶Mdm2，Lnx，Siah1，Itch相互作用（能够将目的蛋白质多聚泛素化，进而被蛋白酶体降解）。在Numb与肿瘤形成的研究中发现，Numb通过参与维持细胞极性和不对称分裂，上皮间质转化，蛋白质泛素化降解，抑制Notch，Hedgehog-Gli(简称Hh-Gli或Hh)信号传导通路，上调P53活性而广泛参与细胞增殖与分化、凋亡与再生等肿瘤发生的众多重要的病理生理过程，发挥其抑制肿瘤形成的作用。最近的研究表明，Numb在乳腺癌，非小细胞肺癌，唾液腺癌，成神经管细胞瘤等某些人类肿瘤中都有不同程度的表达缺失;在对人小脑髓母细胞瘤的研究中发现Numb能够通过介导Itch依赖的泛素化降解Gli1，从而抑制Hh-Gli通路。然而，Numb在MPM中的表达、对Gli1的调控作用以及Numb与肿瘤形成的关系尚未见报道。
　　 为了探讨Numb在MPM发生、发展中的作用，进一步以Numb为靶点进行基因治疗提供理论依据，本论文从以下三个方面进行了研究:
　　 一.Numb、Gli1在MPM组织中的表达及其临床意义;
　　 二.Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达及对Gli1的调控作用;
　　 三.过表达Numb对NCI-H2452细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响。
　　 实验方法：
　　 一.探讨Numb、Gli1在MPM组织中的表达及其临床意义
　　 免疫组织化学法检测Numb、Gli1在61例MPM组织及22例正常胸膜组织中的表达，卡方检验进行组间比较;Kruskal-Wallis或Mann-Whitney法检测Numb、Gli1在MPM中表达与临床病理参数之间的关系;Spearman等级相关分析检验Numb与Gli1的相互关系;Kaplan-Meier法log-rank检验进行单因素生存分析，Cox回归进行多因素生存分析，检测Numb、Gli1及各项临床病理参数对预后的影响。
　　 二.研究Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达及对Gli1的调控作用
　　 1.首先用qRT-PCR及Westernblot方法检测了Numb在NCI-H2452细胞中的表达，同时我们将已被证明表达Numb的人胚肾细胞293T作为对照;Westernblot方法检测蛋白酶体抑制剂MG132作用于NCI-H2452细胞后对Numb蛋白表达的影响。
　　 2.Numb表达载体体外瞬时转染NCI-H2452细胞，Westernblot方法检测Numb、Gli1表达;蛋白酶体抑制剂MG132作用于Numb转染组，Westernblot方法检测对Gli1表达的影响。
　　 三.检测过表达Numb对MPM细胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化疗敏感性的影响
　　 1.为检测过表达Numb对NCI-H2452细胞增殖能力的影响，分别于转染后48、72h采用MTT法检测细胞存活率。
　　 2.为检测过表达Numb对NCI-H2452细胞凋亡的影响，转染后72h采用Hoechst染色和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术分别检测细胞凋亡形态的变化和凋亡率。
　　 3.为研究Numb促进NCI-H2452细胞凋亡的机制，采用Westernblot方法检测凋亡相关蛋白caspase3，9以及细胞色素C、XIAP、survivin的变化。
　　 4.为了进一步确定Numb对MPM化疗敏感性的影响，过表达Numb后分别加入3种不同的化疗药物顺铂、培美曲塞、卡铂作用24h，采用MTT方法检测细胞存活率。
　　 结果：
　　 一.Numb、Gli1在MPM组织中的表达及其临床意义
　　 Numb阳性表达率在MPM组明显低于正常对照组(P＜0.05);MPM组织中Numb表达与Ki-67标记指数密切相关，Ki-67≤25％的患者中Numb表达强，Ki-67＞25％的患者中Numb表达弱(P＜0.05)。Gli1阳性表达率在MPM组明显高于正常对照组(P＜0.05);Gli1胞核表达与IMIG分期密切相关，IMIG分期为初期的患者Gli1表达弱，进展期的患者Gli1表达强(P＜0.05)。在MPM组织中，Numb表达与Gli1胞核表达呈显著负相关(r=-0.361，P＜0.05);Kaplan-Meier法log-rank检验进行单因素生存分析，结果显示在MPM组织中Numb表达缺失与预后不良有关(P＜0.05);此外，病理类型中的上皮型较之于非上皮型为有利预后因素(P＜0.05)。Cox回归模型分析显示只有病理类型为独立的预后因素(HR=1.952，95％CI1.044，3.48P＜0.05)。
　　 二.Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达及对Gli1的调控作用
　　 1.Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达
　　 结果显示NumbmRNA在NCI-H2452和293T细胞表达水平相似，但在蛋白水平，Numb在NCI-H2452细胞中的表达明显低于293T。经蛋白酶体抑制剂MG132作用后，Numb蛋白表达明显升高，提示Numb在NCI-H2452细胞中低表达或表达缺失与转录后抑制有关。
　　 2.在NCI-H2452细胞中过表达Numb后Gli1蛋白表达受到抑制
　　 Numb蛋白在Numb转染组中表达明显高于空载体对照组，外源性表达Numb成功。Gli1mRNA在Numb转染组和空载体对照组比较无明显差异;而Gli1蛋白在Numb转染组较之于空载体对照组表达降低，提示Numb抑制了Gli1蛋白表达。蛋白酶体抑制剂MG132作用于Numb转染组后，Gli1蛋白表达恢复，提示在MG132作用下Numb对Gli1蛋白抑制作用消失。
　　 三.过表达Numb对MPM细胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化疗敏感性的影响
　　 1.过表达Numb后NCI-H2452细胞增殖受到抑制
　　 MTT检测结果显示转染外源性Numb基因48、72h后，Numb转染组与空载体对照组或空白对照组比较，OD值明显降低，结果有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)提示过表达Numb能够抑制NCI-H2452细胞增殖活力。
　　 2.过表达Numb促进NCI-H2452细胞的凋亡
　　 转染外源性Numb基因72h后，Hoechst染色在荧光显微镜下观察发现Numb转染组细胞凋亡显著，出现明显的核固缩，核碎裂，而空载体对照组和空白对照组凋亡细胞相对较少;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）显示，Numb转染组与空载体对照组或空白对照组比较，凋亡率明显升高，结果有显著性差异（均P＜0.01），提示过表达Numb后，促进NCI-H2452细胞凋亡。
　　 3.Numb通过激活caspase-9介导的内源性凋亡途径促进NCI-H2452细胞凋亡
　　 Westernblot结果显示同空载体对照组比较，Numb转染组细胞caspase-3，9活性蛋白和胞质细胞色素C表达明显升高，XIAP、survivin表达减弱。提示Numb可能通过激活细胞色素C/caspase-9介导的内源性凋亡途径促进NCI-H2452细胞凋亡。
　　 4.过表达Numb增强NCI-H2452细胞对顺铂和卡铂的化疗敏感性。
　　 MTT检测结果显示在相同浓度顺铂或卡铂作用下，Numb转染组的细胞存活率明显低于空载体对照组和空白对照组(P＜0.05，P＜0.01);过表达Numb对培美曲塞作用的3组细胞存活率无明显影响。提示过表达Numb增强NCI-H2452细胞对铂类化疗药物的敏感性。
　　 结论：
　　 1.Numb在MPM组织中的表达减弱甚至缺失，并且与高Ki-67标记指数及不良预后密切相关。
　　 2.Gli1在MPM组织中表达增强，与IMIG分期相关;Numb与Gli1表达负相关，Numb可能通过泛素-蛋白酶体途径抑制Gli1蛋白的表达。
　　 3.过表达Numb能够抑制MPM细胞的增殖能力，并通过caspase-9介导的内源性凋亡途径促进MPM细胞的凋亡。
　　 4.过表达Numb能够增强MPM细胞对铂类化疗药物的敏感性。
　　 创新性和意义
　　 1.本课题首次发现Numb在MPM组织中表达减弱甚至缺失，并且为预后不良的指标。
　　 2.本课题首次在MPM中研究了Numb与Gli1的相关性及Numb对Gli1的调控作用。
　　 3.本课题首次在MPM中研究了Numb对肿瘤细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响，为以Numb为靶点进行基因治疗提供了理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 抑癌基因Numb在恶性胸膜间皮瘤中表达的临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 Numb在恶性胸膜间皮瘤细胞株NCI-H2452中的功能研究

第一节 Numb在NCI-H2452细胞中的表达及对Gli1的调控作用

前言

材料与方法

结果

讨论

第二节 过表达Numb对NCI-H2452细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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