聚l-谷氨酸/壳聚糖材料在脂肪组织工程以胆管癌三维培养模型中应用的实验研究

摘要

第一部分聚L-谷氨酸/壳聚糖材料在脂肪组织工程中应用的实验研究
　　 目的
　　 每年全世界有数百万的患者因创伤、肿瘤切除手术和先天性发育缺陷等原因会导致的大面积软组织缺损，大范围的软组织缺损是无法自愈的，需要通过手术进行等方法修复重建。组织修复重建的主要目的不仅仅是恢复正常的组织结构，更重要的是通过对缺损的修复，恢复正常的组织功能，减轻患者焦虑、自卑等不良心理。
　　 传统的软组织修复重建方法主要包括游离脂肪移植，复合组织瓣移植或人工合成替代物的植入等方式，它们都存在着各自的缺点，如游离脂肪移植成活率低、容易吸收(体积降低40％-60％);复合组织瓣移植，对供区组织损伤大，操作复杂，不易塑形;人工合成替代物，如硅胶等可能会引起机体不同程度的排异反应，长期效果可能不理想。
　　 随着细胞生物学与生物材料科学的发展，以种子细胞、支架材料构建组织为基本特征的组织工程学应运而生，为解决软组织乃至器官缺损提供了新的思路。脂肪组织工程的基本策略就是利用种子细胞与具有生物相容性和生物降解性的生物材料结合经过生长因子诱导构建脂肪组织。成功构建组织工程化脂肪的关键在于:①种子细胞的选择和获得;②具有良好生物降解性和组织相容性的三维支架材料;③种子细胞增殖和分化的微环境。
　　 本实验以人脂肪干细胞(adiposetissue-derivedadultstemcells，ADSC)作为种子细胞，以水溶性聚L-谷氨酸/壳聚糖(poly[L-glutamicacid]/chitosan，PLGA/CS)静电络合而成的新型多孔材料作为支架材料，构建组织工程化脂肪。探讨新型支架材料聚L-谷氨酸/壳聚糖的细胞相容性及与ADSC体外及体内成脂的状况，证实人ADSC能够在水溶性聚L-谷氨酸/壳聚糖支架材料上构建组织工程化脂肪，为脂肪组织工程增添新的内容。
　　 方法
　　 一、人脂肪干细胞体外成脂分化潜能的研究
　　 1.应用酶消化法从吸脂手术的患者中获取新鲜脂肪组织，提取ADSCs，体外培养扩增，取第3代ADSCs用于实验研究。
　　 2.流式细胞术检测ADSCs分化群表面抗原CD13、CD14、CD34、CD44、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106和CD166的表达。
　　 3.利用不同的生长因子体外诱导，对ADSCs成骨、成脂、成软骨三向分化性能进行鉴定。
　　 4.体外诱导ADSCs成脂分化21天，观察细胞形态学变化，Oil-redO染色及其定量检测细胞内脂滴的形成情况。
　　 二、ADSCs于PLGA/CS支架材料体外成脂的研究
　　 1.以聚乳酸PLA微球（直径在200-300μm）作为致孔剂，利用冷冻干燥技术和静电络合技术制成球形孔结构的PLGA/CS支架材料。
　　 2.用扫描电镜（scanningelectronmicroscope，SEM）和荧光染料DiL标记的方法定性检测ADSCs在PLGA/CS支架材料上粘附和增殖情况。
　　 3.通过Hoechst33258染色的DNA定量方法，绘制成脂分化诱导组和未诱导组的ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖曲线。
　　 4.通过定量检测细胞/材料复合物乳酸脱氢酶的释放，评价PLGA/CS材料对ADSCs的细胞毒性。
　　 5.用Oil-redO染色法，定量检测ADSCs接种到PLGA/CS材料经成脂诱导后细胞内脂滴形成情况，并与未诱导组进行对比。
　　 6.用RT-PCR法检测诱导组和未诱导组的ADSCs接种PLGA/CS支架材料后的脂特异性基因的表达情况，包括过氧化物酶体增生物激活物受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma2，PPARγ2)、脂肪酸结合蛋白（fattyacid-bindingprotein，aP2）、脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase，LPL)、脂连接蛋白(adiponectin)。
　　 三、ADSCs在PLGA/CS支架材料体内成脂研究
　　 以ADSC接种在PLGA/CS支架材上后体外成脂诱导2周为实验组，以空白PLGA/CS支架材料为对照组。12只SCID裸鼠随机分为两组，每组6只，将实验组和对照组材料分别移植于裸鼠皮下。移植6周后取出植入物，测量其体积变化来观察PLGA/CS支架材料降解情况;OCT包埋进行冰冻切片，Oil-redO染色检测其脂肪形成情况。
　　 结果
　　 1.成功的从脂肪抽吸术获取的新鲜脂肪组织中，原代培养出ADSCs，细胞活性良好，增殖旺盛。流式细胞术的检测结果显示，实验所用P3ADSCs的CD13、CD34、CD44、CD90、CD105、CD166以及CD49d阳性表达，CD14、CD45与CD31阴性表达;鉴定结果显示其具有成骨、成软骨和成脂的三向分化潜能。成脂诱导过程中，细胞形态由“长梭形”向圆形脂肪细胞转化，Oil-redO染色及其定量测定显示随时间增加，细胞内脂滴形成逐渐增多。
　　 2.PLGA/CS材料外观呈多孔海绵状，孔径均一，孔间连通性良好，孔隙率＞90％，对ADSCs显示出良好的细胞相容性;SEM与DiL染色的共聚焦显微镜观察显示ADSCs于PLGA/CS支架材料上粘附、增殖良好;PLGA/CS支架材料的细胞毒性对接种的ADSCs影响不大。Oil-redO染色及其定量检测显示实验组脂滴累积明显高于对照组;RT-PCR结果显示，实验组成脂特异性基因表达均增加，且明显高于对照组。
　　 3.裸鼠体内移植物6周后取出，可见移植物体积完整，有明显的血管长入;体积测量结果显示，实验组和对照组体积均有不同程度降低，分别为初始体积的90.5％和82.3％，两组间差别无统计学意义(p＞0.05)。冰冻切片Oil-redO染色显示实验组有新生脂肪形成，而对照组没有。
　　 结论
　　 1.ADSCs具有成脂分化潜能，是脂肪组织工程理想的种子细胞。
　　 2.ADSCs在PLGA/CS支架材料上能较好粘附、增殖以及体外和体内的成脂分化，说明PLGA/CS支架材料对ADSCs具有良好的生物相容性和促成脂分化的潜能，表明PLGA/CS可能是一种理想的脂肪组织工程细胞支架材料。
　　 3.PLGA/CS支架材料在裸鼠体内可以降解，表明其具有生物可降解性，但材料的降解率与体内脂肪形成的动力学关系仍需要进一步研究。
　　 创新性及研究的意义
　　 本研究首次将聚L-谷氨酸/壳聚糖静电络合而成的支架材料应用于脂肪组织工程中研究，成功的完成了ADSCs在PLGA/CS支架材料上体外和体内脂肪组织的构建，为组织工程支架以及整个脂肪组织工程的发展增加了新的实验资料。
　　 第二部分聚L-谷氨酸/壳聚糖材料在胆管癌三维培养模型中应用的实验研究
　　 目的
　　 胆管癌（Cholangiocarcinoma,CC）泛指起源于胆管上皮的恶性肿瘤，发病率仅低于肝细胞肝癌，排在肝胆系统肿瘤中的第二位。根据解剖部位不同，胆管癌可分为肝外胆管癌和肝内胆管癌。由于胆管癌发病隐匿，早期症状不明显，发病时已近中晚期，手术切除治愈率低，预后不良。
　　 流行病学调查显示，近年来胆管癌的发病率明显有升高趋势，逐渐成为重要的恶性肿瘤致死的病因，日益受到了国内外学者越来越广泛的关注。尽管诊断和治疗方法不断的进步，胆管癌的预后依然不容乐观。建立适宜的研究模型，充分了解胆管癌发生和发展的分子机制，对胆管癌的治疗和预后改善具有重要意义。
　　 上皮间质转化（epithelialtomesenchymaltransition，EMT）是指细胞从上皮形态到间质成纤维形态的转化过程，主要表现为上皮特点的失去和移动能力的获得。其重要的改变包括E-钙粘素（E-cadherin）介导的细胞间粘连、其他上皮标记和细胞极性的丧失，同时伴随着移动能力的获得和细胞骨架重组。EMT不仅发生在胚胎形成早期和器官组织慢性纤维化过程中，也发生在肿瘤局部侵袭，远处转移和药物抵抗的过程中。肿瘤的浸润过程，肿瘤细胞发生EMT，彼此分离，移动入基底膜，侵袭到临近的结缔组织中。目前已证实很多肿瘤的扩散和转移都是通过EMT实现的，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌，胆管癌等。EMT的过程受到很多环境因素和信号通路的调控。在这些信号通路中，转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)是EMT发生及肿瘤和其他病理现象发展中最重要的诱导因子。
　　 本研究中，我们首先在二维(twodimensional，2D)模型中探讨了TGF-β1对肝内胆管癌细胞HCCC9810EMT过程的影响，然后利用PLGA/CS体外建立肿瘤细胞三维(threedimensional,3D)培养模型，观察了3D模型对HCCC9810细胞生长、增殖及侵袭能力的影响，不仅为胆管癌的基因治疗提供了靶点，同时将组织工程理念引领到肿瘤研究中，为肿瘤的生物学特性和治疗方法的研究提供了新的思路。
　　 方法
　　 1.以TGF-β110ng/ml浓度体外2D诱导HCCC9810细胞，设为实验组，正常生长培养液培养的HCCC9810细胞为对照组，采用光学显微镜观察细胞形态的变化;用体外划痕试验(woundhealingassay)检测细胞移动能力的改变;免疫荧光定性检测上皮特性指标，包括E-cadherin、β-连环蛋白(β-catenin)和角蛋白(Pan-cytokeratins，Pan-CK)，以及间质特性指标，包括波形蛋白(Vimentin)和纤维粘连蛋白（Fibronectin）的变化以及骨架蛋白F-actin的重组情况;WB和real-timePCR法检测上皮和间质特性指标的蛋白和mRNA水平的表达情况。
　　 2.将HCCC9810细胞接种于PLGA/CS材料上，建立PLGA/CS胆管癌三维培养模型，用SEM和荧光染料DiL标记的方法定性检测HCCC9810细胞在PLGA/CS材料上粘附和生长情况;用Hoechst33528染色DNA定量检测HCCC9810细胞在PLGA/CS材料上的增殖情况，并与2D结果进行对比;用real-timePCR法检测上皮特性指标（包括E-cadherin和β-catenin）和间质特性指标（Fibronectin、Vimentin和N-钙粘素[N-cadherin]）以及TGF-β1的mRNA表达情况。
　　 结果
　　 1.体外2D培养下，TGF-β1诱导HCCC9810细胞逐渐失去上皮“铺路石”形状，转化成成纤维样“长梭形”形状;划痕试验显示实验组的细胞获得移动能力;免疫荧光结果显示胆管癌细胞不表达E-cadherin，而β-catenin由诱导前细胞膜表达变成诱导后细胞质中也有表达，Pan-CK诱导后表达降低;诱导后间质细胞标志Vimentin和Fibronectin明显增强，同时细胞骨架蛋白F-actin发生重组;WB结果显示，上皮细胞特性标志中，E-cadherin无表达，β-catenin和Pan-CK诱导后表达不同程度降低，而间质细胞特性标志中，Vimentin和Fibronectin表达明显增加，N-cadherin表达未有明显变化;real-timePCR结果显示mRNA水平上皮细胞特性标志中，E-cadherin和β-catenin诱导后表达显著性降低，间质细胞特性标志Vimentin，Fibronectin和N-cadherin均不同程度增加，均具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 2.HCCC9810细胞接种在PLGA/CS材料上表现为粘附、增殖良好;DNA定量检测结果显示细胞于材料上的增殖速率较2D培养速度降低，这更加符合肿瘤体内生长的真实情况;real-timePCR结果显示，细胞接种材料后，E-cadherin和β-catenin的mRNA表达随时间逐渐降低，第21天表达显著降低(p＜0.05)，Fibronectin和vimentin于细胞接种材料后14天和21天mRNA表达明显增高(p＜0.05);N-cadherin的mRNA表达未见明显变化;TGF-β1的mRNA水平于细胞接种材料14天和21天后表达明显增加(p＜0.05)。
　　 结论
　　 1.TGF-β1能够诱导胆管癌发生EMT，证实TGF-β1及其信号通路在胆管癌的侵袭和转移中具有挥重要作用，可作为胆管癌基因治疗的靶点。
　　 2.组织工程支架材料PLGA/CS可用于体外3D肿瘤细胞培养模型的建立，较传统2D培养模式更真实的反应肿瘤体内生长情况，且长时间培养，肿瘤细胞自分泌TGF-β1，使细胞移动和侵袭能力增加，符合胆管癌体内自分泌或旁分泌TGF-β1实现局部浸润和远处转移的特点。
　　 创新性及研究意义
　　 1.证实了TGF-β1能够诱导胆管癌发生EMT，提出TGF-β1可作为胆管癌基因治疗的靶点;
　　 2.组织工程支架材料PLGA/CS可用于体外3D肿瘤细胞培养模型的建立，为肿瘤侵袭的的研究提供更加新的研究方法。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 聚L-谷氨酸／壳聚糖材料在脂肪组织工程应用的实验研究

前言

材料

方法

一、人脂肪干细胞体外成脂分化潜能的研究

二、ADSCs于PLGA／CS支架材料体外成脂的研究

三、ADSCs-PLGA／CS复合物体内成脂的研究

四、统计学分析

结果

一、人脂肪千细胞体外成脂分化潜能的研究

二、ADSCs于PLGA／CS支架材料体外成脂的研究

三、体内脂肪形成及回植物体积的测定

讨论

小结

附图表

参考文献

第二部分 聚L-谷氨酸／壳聚糖材料在构建胆管癌三维培养模型中应用的实验研究

第一节 TGF-β1诱导人胆管癌HCCC9810细胞发生上皮-间质转化的研究

前言

材料

方法

结果

讨论

小结

第二节 聚L-谷氨酸／壳聚糖支架构建三维培养模型及对肿瘤生长及侵袭能力的影响

前言

材料

方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

致谢

在读期间主要科研成果

附件1 文献综述

附件2 英文文章1

附件3 英文文章2