miR-142-5p在动脉粥样硬化斑块中的表达及通过TGF-β2调控人巨噬细胞凋亡功能的作用

摘要

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病，coronaryheartdisease，CHD)近年的发病率和死亡率逐年上升，成为威胁人类健康的重大主要原因。动脉粥样硬化是心血管疾病的一个主要的危险因素，近年研究表明microRNAs在动脉粥样硬化斑块的形成及发展过程中参与并起着重要的基因调控作用。动脉粥样硬化和心血管疾病的进展中，microRNAs参与了包括内皮功能的变化、血管平滑肌细胞增殖和迁移、巨噬细胞的功能以及泡沫细胞的形成。巨噬细胞参与先天免疫系统，帮助清除凋亡细胞和去除细胞碎片产生的组织重构和细胞坏死;巨噬细胞可以释放炎性物质，影响动脉粥样硬化。在冠心病的发生及发展过程中，炎症起着重要的作用。研究发现microRNAs不但参与了炎症细胞的发育、分化，还参与调控炎症细胞的活化以及各种炎症因子的相互作用。mir-142-5p目前在肿瘤、免疫疾病、淋巴组织及红细胞胚胎干细胞方面都有研究，但在动脉粥样硬化方面的研究尚未见报道。
　　 研究目的：
　　 (1)探讨mir-142-5p在动脉粥样硬化斑块中表达的变化;
　　 (2)进一步探讨mir-142-5p在人巨噬细胞中的表达;
　　 (3)探讨mir-142-5p的靶基因并观察其对人巨噬细胞凋亡功能的影响。
　　 方法：
　　 1.1、动物模型的构建
　　 实验选用8周龄的雄性ApoE-/-小鼠，在普食喂养3天后转为高脂喂养;2周后给予右侧颈动脉套管术;给予套管高脂饮食8周，根据干预措施不同分为3组（12只/组）:空白对照组;稳定斑块组;易损斑块组。易损斑块组给予限制性应激及噪音干预4周（前两周4h/天，后2周6h/天，5天/周）后，行麻醉处死小鼠采集血样、收集样本入液氮罐中。
　　 1.2、microRNA芯片检测
　　 将取材后的颈动脉血管在冰上清理后送康城生物公司进行microRNA芯片检测，筛查在易损斑块表达变化较明显的microRNA，明确mir-142-5p在动脉粥样硬化斑块中的表达变化。
　　 1.3、观察mir-142-5p在血管壁不同细胞中的表达，选择变化明显的细胞进一步研究
　　 在人平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞进行培养，用ox-LDL刺激，应用RT-PCR技术比较mir-142-5p在不同细胞中的表达变化。
　　 1.4、寻找mir-142-5p的靶基因
　　 通过数据库及预测软件预测mir-142-5p的靶基因:TGF-β2;通过脂质体2000将mir-142-5p的inhibitor及mimics转染进入人巨噬细胞中，应用Western-bolt及RT-PCR技术对靶基因TGF-β2进行验证。
　　 1.5、mir-142-5p及TGF-β2干预对人巨噬细胞凋亡功能的影响
　　 应用转染技术将mir-142-5p的inhibitor、mimics及TGF-β2的inhibitor转染进入人巨噬细胞中，通过AnnexinV-PE(AnnexinV-PEApoptosisDetectionKit)细胞凋亡检测试剂盒在激光共聚焦显微镜下观察其对人巨噬细胞功能的影响。
　　 1.6、统计学分析
　　 两组之间的差异比较采用独立样本t检验;多组之间差异的比较采用了方差分析(ANOVA)。以上结果应用了SPSS17.0软件进行统计分析。以P＜0.05作为具有统计学意义。
　　 结果：
　　 2.1、mir-142-5p在斑块中的表达
　　 MicroRNA芯片检测结果显示，mir-142-5p在稳定斑块组中的表达比空白对照组高6.8倍;mir-142-5p在易损斑块组中的表达比空白对照组高2.7倍。
　　 2.2、mir-142-5p在三种细胞中的表达
　　 培养人内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞，并用ox-LDL50ng/ml刺激24h后提取microRNA并应用RT-PCR技术检测mir-142-5p在三种细胞中的表达，结果显示内皮及平滑肌细胞中mir-142-5p的表达在对照组与ox-LDL干预组间差异均低于1.5倍（P＞0.05），而mir-142-5p在巨噬细胞ox-LDL干预组中的表达高于对照组5.4倍（P＜0.05），与芯片结果趋势符合。
　　 2.3、mir-142-5p的靶基因预测
　　 应用数据库靶基因预测软件预测mir-142-5p的靶基因可能为:TGF-β2;通过转染技术将mir-142-5p的inhibitor及mimics转染进入人巨噬细胞中，提取蛋白及RNA，Western-bolt及RT-PCR的结果均提示TGF-1β2可能为mir-142-5p的靶基因。
　　 2.4、Mir-142-5p及TGF-β2干预对人巨噬细胞凋亡功能的影响
　　 control组细胞基本无凋亡;与control组比较，ox-LDL组细胞凋亡增加（凋亡细胞率:6.83+0.17％，P＜0.05）;mir-142-5pmimics+ox-LDL组（凋亡细胞率:5.27±0.19％）和TGF-β2inhibitor+mir-142-5pinhibitor+ox-LDL组（凋亡细胞率:1.38±0.27％）及TGF-β2inhibitor+ox-LDL组（凋亡细胞率:2.74±0.21％）细胞凋亡也较ox-LDL组少(P＜0.05);与其它组比较mir-142-5pinhibitor+ox-LDL组凋亡细胞最多(凋亡细胞率:12.31+0.22％，P＜0.05)。凋亡细胞率=凋亡细胞数/总细胞数％。
　　 结论：
　　 1、mir142-5p在动脉粥样硬化斑块中表达上调。
　　 2、细胞学检测显示mir142-5p在人巨噬细胞中表达上调，易损斑块中表达增加明显与芯片检测的结果趋势相符，具有抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡作用。
　　 3、TGF-β2可能是mir142-5p的靶基因并参与调控人巨噬细胞凋亡。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 资料与方法

1．1 实验动物

1．2 使用仪器

1．3 实验试剂

1．4 动物实验步骤

1．5 MicroRNA芯片检测

1．6 人巨噬细胞的培养

1．7 平滑肌细胞及内皮细胞的培养

1．8 细胞转染

1．9 细胞研究分组

1．10 实时定量RT-PCR

1．11 Western-Blot分析

1．12 细胞凋亡检测

1．13 统计学方法

2 结果

2．1 通过miRNA基因芯片筛查明定了mir-142-5p在斑块中的表达变化

2．2 观察mir-142-5p在血管壁主要细胞中表达的变化，确定了进一步研究的巨噬细胞

2．3 mir-142-5p的靶基因预测

2．4 mir-142-5p对人巨噬细胞凋亡功能的影响

3 讨论

3．1 MicroRNA与动脉粥样硬化

3．2 巨噬细胞凋亡与动脉粥样硬化

3．3 TGF-β2可能为mir-142-5p的靶基因

3．4 本研究的创新性和限制性

4 结论

5 附图、表

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学位论文