PDCD4在脂多糖/d-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤中的作用研究

摘要

目的：
　　 程序性死亡因子4，PDCD4(programmedcelldeath4，PDCD4)是近年来发现的抑癌基因，现已证实它可以在转录和翻译水平调控多种基因的表达，抑制肿瘤的生长、浸润和转移。我们的前期研究结果已经证实PDCD4在卵巢癌和神经胶质瘤的发展中发挥了非常重要的作用，然而，最近一些研究显示PDCD4在许多炎症性疾病中也发挥了重要的作用。已有报道，PDCD4基因敲除（Pdcd-/-4）小鼠抵抗I型糖尿病及实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的发生，并且可以降低脂多糖(lipopolysacchrides，LPS)诱导的小鼠死亡率。上述结果提示PDCD4是一个促炎蛋白。然而，另外有报道指出，PDCD4敲除的RAW264.7巨噬细胞系经LPS刺激后可以产生更多的促炎因子TNF-α，这提示PDCD4是一个抗炎因子。因此，PDCD4在炎症中的作用目前仍不清晰。
　　 由肠源性内毒素导致的急性肝损伤是临床上常见的肝功能衰竭和患者死亡的原因之一。内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分—LPS，它可以强有力地激活枯否细胞和内皮细胞，具有广泛的生物学效应。LPS刺激枯否细胞使其产生并分泌炎性细胞因子如:TNF-α、IL-1β、IL-6等，其分泌依赖于MAPK和NF-κB信号通路的激活。这些炎性因子，特别是TNF-α，可以诱导肝细胞的凋亡和坏死。在这个过程中，枯否细胞受LPS刺激后激活，在炎症反应中扮演了重要的角色，而肝细胞是主要的靶细胞。D-半乳糖胺作为一种氨基糖，可以诱导体内UTP的消耗从而增强LPS的肝脏毒性。利用LPS联合D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)给小鼠进行腹腔注射，可以诱导特异性的肝损伤产生，而对心、脾、肺等其他器官未造成明显损伤。因此，LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤模型是目前研究内毒素导致的肝损伤的理想动物模型。
　　 本实验的目的是研究PDCD4在LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤中的作用，并对其机制进行进一步探讨。通过本研究的完成，不仅有利于阐明PDCD4在炎症中的调控作用，而且为揭示内毒素诱导急性肝损伤的发病机制、寻找新的靶点奠定了坚实的基础。
　　 方法：
　　 一、PDCD4基因缺失后对急性肝损伤的影响
　　 以Pdcd-/-4小鼠为实验组，以同系且同龄的野生型C57BL/6小鼠为对照组，采用50μg/kgLPS及800mg/kgD-GalN腹腔注射建立内毒素性急性肝损伤动物模型。分别在建模后0小时、3小时、5小时获得血清和肝脏标本进行以下各指标的检测。
　　 1.观察实验组和对照组小鼠肝脏大体观，检测两组小鼠肝重和体重的比值变化。
　　 2.利用全自动生化分析仪检测两组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的含量。
　　 3.利用HE染色做病理学检测，并利用破碎DNA的原位末端标记技术(TUNEL)试剂盒检测凋亡肝细胞的百分数。
　　 4.利用免疫组化染色（immunohistochemistry，IHC）及westernblot检测两组小鼠肝组织中caspase-3的表达情况。
　　 二、PDCD4基因缺失后对小鼠体内炎性因子水平的影响
　　 1.利用BD流式细胞因子微球组合试剂盒检测实验组和对照组小鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-12p70的含量，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IL-1β的含量。
　　 2.利用RT-PCR的方法检测肝组织中各种炎性因子(Tnfa、Il1b、Il6、Mcp1、Il10、Il12p40、Il12p35)mRNA的水平。
　　 三、PDCD4基因缺失后对炎症信号通路活化的影响
　　 1.利用westernblot的方法检测两组小鼠肝组织中炎症信号通路MAPK的活化情况。
　　 2.利用westernblot和IHC的方法检测两组小鼠肝组织中炎症信号通路NF-κB的活化情况。
　　 四、体外检测PDCD4基因缺失后对小鼠腹腔巨噬细胞的影响
　　 分离Pdcd-/-4小鼠及同系且同龄的野生型C57BL/6小鼠的腹腔巨噬细胞，在体外利用LPS刺激，分别在刺激后0小时、3小时、5小时收集其培养上清和巨噬细胞蛋白进行以下各指标的检测。
　　 1.利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中TNF-α及IL-6的含量。
　　 2.利用westernblot的方法检测两组小鼠腹腔巨噬细胞中两条主要的炎症信号通路MAPK和NF-κB的活化情况。
　　 结果：
　　 一、在脂多糖/D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤中PDCD4的缺失加重肝细胞的凋亡和坏死程度
　　 1.肝脏大体形态显示与对照组小鼠相比，建模后5小时，Pdcd-/-小鼠肝脏肿胀更为明显，并呈现紫黑色，肝脏与体重的比值明显高于对照组小鼠;
　　 2.建模后5小时，Pdcd-/-4小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量显著高于对照组小鼠;
　　 3.建模后5小时，H&E染色结果显示与对照组小鼠相比，Pdc-/-4小鼠的肝组织小叶正常结构消失，出现片状出血坏死及炎性细胞浸润;
　　 4.肝组织切片的TUNEL染色显示，诱导肝损伤后5小时，Pdcd-/-4小鼠肝脏细胞TUNEL阳性细胞数量显著高于对照组小鼠。肝组织切片caspase-3免疫组化染色和肝组织蛋白westernblot结果进一步显示，建模后5小时，Pdc-/-4小鼠肝组织caspase-3活化程度显著高于对照组小鼠。
　　 二、在脂多糖/D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤中PDCD4的缺失导致血清及肝脏局部某些炎性细胞因子的水平增加
　　 1.建模后3小时，Pdcd-/-4小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1水平显著高于对照组小鼠;
　　 2.建模后3小时，Pdcd-/-4小鼠肝脏组织中Tnfa，Il1b，Il6和Mcp1mRNA水平显著高于对照组小鼠。
　　 三、PDCD4的缺失促进LPS诱导的肝脏内MAPK和NF-κB通路的活化
　　 1.建模后3小时，Pdcd-/-4小鼠肝脏组织中p-JNK的水平显著高于对照组小鼠，建模后5小时，Pdcd-/-4小鼠肝脏组织中p-ERK、p-P38水平都显著高于对照组小鼠;
　　 2.建模后3小时和5小时，Pdcd-/-4小鼠肝脏组织中p-P65的水平显著高于对照组小鼠。
　　 四、PDCD4基因缺失后增强LPS诱导的腹腔巨噬细胞活化
　　 1.在LPS刺激3小时和5小时后，Pdcd-/-4小鼠的腹腔巨噬细胞上清中TNF-α显著高于对照组小鼠，在LPS刺激5小时后，Pdcd-/-4小鼠的腹腔巨噬细胞上清中IL-6显著高于对照组小鼠。
　　 2.LPS刺激3小时后，Pdcd-/-4小鼠的巨噬细胞中磷酸化的P38，ERK表达显著增加，LPS刺激5小时后，Pdcd-/-4小鼠的巨噬细胞中磷酸化的JNK表达显著增加;
　　 3.LPS刺激3小时和5小时后，Pdcd-/-4小鼠巨噬细胞中磷酸化的P65水平明显高于对照组小鼠。
　　 结论及意义：
　　 以上实验提示PDCD4可以通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的活化，减少肝脏枯否细胞产生促炎性细胞因子，从而在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤中对肝脏起到保护作用。据此，我们首次提出“PDCD4在内毒素诱导急性肝损伤中具有重要抑制作用”的新观点。
　　 该研究结果不仅为PDCD4功能的研究提供新的思路，而且对揭示内毒素诱导急性肝损伤的发病机制、寻找新的防治方法均具有重大的理论价值和潜在的应用价值。