DDP-IV抑制剂对糖尿病大鼠左室心肌重塑与功能的影响及作用机制

摘要

研究背景:
　　 糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)病程缓慢，并发症多且常累及心、脑、肾等全身重要脏器，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)为常见、严重的并发症之一。DM糖脂代谢紊乱可导致心肌组织病理改变为心肌细胞肥大、凋亡、坏死，间质纤维化，炎症等，表现为进行性左心室结构改变、功能异常，死亡率极高。DM治疗现状目前并不乐观，仍存在诸多问题，单纯降低血糖治疗并不能完全降低心血管病事件。因此，新型降糖药物除具有保护胰岛β细胞功能、降糖作用外，还应具有保护靶器官、降低死亡率的作用，成为当前基础研究与临床治疗策略的重点。
　　 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是主要源于肠道末端L细胞分泌的肠促激素，受体在胰岛、心肌、脑等组织内广泛表达，作用在机体摄入食物后，具有葡萄糖依赖性释放、促进餐后胰岛素分泌等作用。2型DM患者体内，GLP-1分泌水平或活性显著下降，且内源性GLP-1可被二肽基肽酶(DPP-Ⅳ)快速分解。因此，DPP-Ⅳ抑制剂-西格列汀可使内源GLP-1短期不被降解，具有升高GLP-1水平，增强并延迟胰岛素释放来降低血糖。晚近报道证实GLP-1可抑制缺血/再灌注损伤后的细胞凋亡。
　　 报道DPP-Ⅳ抑制剂可上调GLUT-4的表达，GLP-1受体兴奋剂可降低2型DM患者高甘油三酯血症、逆转脂肪肝。DM心肌病变中Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积、排列紊乱，胶原降解酶(主要基质金属蛋白酶系统MMPs/TIMPs)表达异常，晚近报道，GLP-1受体拮抗剂可抑制脂多糖诱导心肌细胞表达MMP-9，提示可能影响胶原酶的表达。心脏舒张功能不全病人外周血中DPP-Ⅳ活性与超声参数E/E'比值呈正相关。GLP-1受体激动剂可抑制TGF-β1表达。尚未见DPP-Ⅳ抑制剂影响DM大鼠糖脂代谢、心肌脂质含量以及心肌胶原网络代谢的相关研究。
　　 心肌细胞凋亡、坏死广泛存在于DM心肌组织中。DM心肌组织中TNF-α、IL-6表达增加，TNF-α与细胞膜TNFR1结合形成信号转导复合物，可引发细胞内Bax、Bcl-2等基因异常表达，致细胞凋亡。受体相互作用蛋白家族(RIPs)是一类重要调节细胞死亡、存活的信号分子，其中RIP3具有自磷酸化、诱导细胞凋亡与激活NF-kB的作用，是参与TNF-α介导的死亡受体凋亡通路的重要信号分子，且RIP3与线粒体能量代谢有关。DM心肌细胞凋亡中，RIP3是否参与其中，及DPP-Ⅳ抑制剂对DM心肌细胞凋亡、RIP3表达的影响以及两者的相关性，目前尚未见相关报道。
　　 DPP-Ⅳ抑制剂（西格列汀）通过抑制DPP-Ⅳ活性，提高GLP-1水平、发挥其生物学作用。因此，在既往研究基础上，本部分从动物水平研究西格列汀对DM大鼠心肌组织的炎症、胶原网络代谢、脂质含量及心肌细胞凋亡等病理改变的影响;对DM心肌组织中RIP3的表达及与凋亡的关系;并探讨该药对DM大鼠左心室功能的影响。通过本研究为DM的防治提供更多的方法。
　　 研究目的:
　　 1.探讨DPP-Ⅳ抑制剂对DM心肌组织的炎症反应、胶原网络代谢、脂质含量及心肌细胞凋亡等心肌重塑的影响;
　　 2.初步探讨RIP3在DM心肌中的表达及DPP-Ⅳ抑制剂的干预作用;
　　 3.评价DPP-Ⅳ抑制剂对DM大鼠左心功能的影响。
　　 研究方法:
　　 1.DM大鼠模型的构建、分组及药物干预
　　 8周龄雄性Wistar大鼠70只，随机分为四组:对照组(n=10只)[Control];糖尿病组(n=20只)[DM];糖尿病+DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀组(低剂量组，30mg/kg/d)(n=20只)[DPP-Ⅳi(Low)];糖尿病+DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀组(高剂量组，50mg/kg/d)(n=20只)[DPP-Ⅳi(High)]。糖尿病各组高脂饲养4周(w)后，糖尿病各组大鼠腹腔注射小剂量STZ30mg/kg。2型糖尿病大鼠成模的诊断标准为:STZ注射后1周内，连续2次空腹血糖≥11.1mmol/L，为糖尿病模型。模型稳定后持续4w，给予对照组、DM组予以生理盐水灌胃，DM药物干预两组分别给予不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀研钵碾碎生理盐水稀释后灌胃，均再继续喂养到实验结束，处死称取心脏重量，计算心脏重量/体重[HW/BW(mg/g)]比值后，留取标本。
　　 2.各组大鼠基本指标、糖脂代谢系列指标及GLP-1水平的监测
　　 实验过程中除常规每2周测1次心率、体重、血压与血糖外，期间，根据研究需要，各时间点为0、4、5、9、13、17、21w，抽取颈静脉窦血1.5ml左右，分离血清，全自动生化分析仪测定血总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇水平，以及免疫发光法测定糖化血红蛋白，酶联免疫法法测血清FFA、GLP-1水平，以及空腹血清胰岛素水平，计算胰岛素敏感指数。
　　 3.心电图
　　 根据实验不同时间点，描记肢体导联(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF)心电图，观察各组大鼠心脏电活动情况并记录心电图。
　　 4.超声心动图
　　 分别在0、13w、17w、21w不同时间点进行超声心动图检查，测定指标如下:左室收缩末内径(LVIDs)、左室舒张末内径(LVIDd)、射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS);二尖瓣口E波最大速度、A波最大速度、E/A;组织多普勒(TDI)二尖瓣环左室侧壁测E'最大速度、A'最大速度，E'/A'，并计算E/E'。
　　 5.Millar导管测左心功能
　　 暴露左室心尖部后，利用10ml注射器针头，内有Milllar导管电极探头直接行心尖穿刺精确控制插入左心室，软件分析心血管参数，左室收缩压(LVSP)，左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt)、左室内压最大下降速率(-dp/dt)。记录、导出有关数据、图像资料，并计算左室松弛时间常数Tau=P/(-dp/dt)。
　　 6.心肌组织病理学检测
　　 实验结束处死动物后，进行取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片，常规HE染色、Masson染色及天狼星红染色，观察心肌组织结构、细胞形态、胶原分布情况等。油红O染色用冻存心肌组织标本。以3％戊二醛固定心肌组织后行透射电镜观察。并测心肌羟脯氨酸含量计算胶原含量。
　　 7.TUNEL染色
　　 石蜡切片行免疫组化法检测凋亡细胞，显微镜下观察、计数阳性染色细胞即凋亡细胞百分比数，并进行统计分析。
　　 8.免疫组织化学染色
　　 取心肌组织石蜡切片，分别免疫组化检测左室心肌组织炎性因子TNF-α、IL-6，胶原Ⅰ、Ⅲ与胶原降解酶MMP-1、9，以及RIP3的表达，并进行综合分析。
　　 9.实时定量RT-PCR基因水平检测
　　 取-80℃冻存的心肌组织，Trizol法提取心肌组织总RNA，实时定量RT-PCR技术检测RIP3 mRNA的表达水平。
　　 10.Western blot检测
　　 取-80℃保存的心肌组织，提取总蛋白，Western-Blot检测左室心肌组织内GLP-1含量及其受体表达，炎性因子TNF-a、IL-6，胶原Ⅰ、Ⅲ，部分胶原降解酶MMP-1、9，以及RIP3的蛋白表达。
　　 11.统计学分析
　　 所用数据用SPSS17.0统计软件进行分析。数值变量资料数据以均数±标准差表示，两组间均数比较采用小样本t检验，多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 研究结果:
　　 1.大鼠的一般情况
　　 糖尿病大鼠造模中，共4只未达标准予以剔除，整个实验中共死亡8只，均为糖尿病各组，最终58只大鼠最终完成实验。其中，Control组10只;DM组15只; DM+ DPP-Ⅳi(Low)组16只;DM+DPP-Ⅳi（High）组17只。对照组精神状态好，体重增加，反应敏捷，毛色白而光泽。DM组出现多饮、多尿和消瘦症状，精神差，体重增加迟缓甚至下降，皮毛脏乱无光泽。药物干预后的两组，与DM组相比，一般情况均较好。实验开始时，各组大鼠心率、体重和血压均无差异（P＞0.05）。结束时，DM各组与对照组比较，体重下降(P＜0.01-0.05)，心率、血压升高(P＜0.01-0.05);药物干预后的两组与DM组比较，体重增加及心率、血压不同程度下降(P＜0.01-0.05)。
　　 2.血液指标检测结果
　　 2.1各组糖脂代谢指标的比较
　　 造模前、高脂饲养4周后，糖尿病各组存在胰岛素抵抗状态;造模后整个实验过程中，DM组与对照组比较，FBG水平、上午10:00血糖水平及HbA1c，均显著升高(P＜0.01);药物干预后的两组与DM组比较，均不同程度下降(P＜0.01-0.05);造模成功后1周FINS无显著差异，ISI显著下降(P＜0.05);实验末，DM组与对照组、两药物干预组比较，FINS显著下降(P＜0.01-0.05);ISI在实验第5-21周，DM组与对照组比较，显著下降（P＜0.05）。
　　 糖尿病造模成功后整个实验过程中，DM各组较对照组，血TC、TG、LDL-C、FFA水平均明显升高(P＜0.01-0.05);药物干预后的两组与DM组比较，均不同程度的降低(P＜0.01-0.05)。
　　 2.2检测空腹、口服葡萄糖30min后GLP-1的血浆水平
　　 糖尿病造模成功并且模型稳定后，于第8周开始给予药物干预，DM与对照组比较，分别空腹、口服葡萄糖30min后GLP-1血浆水平均呈不同程度降低(P＜0.01-0.05);药物干预后的两组与DM组比较，在第13-21周，空腹、口服葡萄糖30min后，GLP-1血浆水平均有不同程度的升高(P＜0.01-0.05)，尤其DM组给予高剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后，与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。
　　 3.心电图的变化
　　 对照组ECG清晰可见P、QRS、T波，QRS波振幅一致。DM组10只心电图异常表现，占66.67％，且QRS“电交替”现象多见，另可见室上速、室速、心动过缓等各种复杂心律失常;两药物干预组中，心电图异常总计14只，占42.42％，未见复杂心律失常且“电交替”减少，提示DPP-Ⅳ抑制剂可改善心脏电活动。
　　 4.超声测量心脏结构和功能指标的变化
　　 左心结构的改变:实验开始时，各组之间左心腔室大小，LVIDs及LVIDd均无显著性差异（P＞0.05）;实验结束时，DM组与对照组比较，LVIDs及LVIDd均显著扩大(P＜0.05);药物干预后的两组与DM组比较，LVIDs及LVIDd均明显减小(P＜0.05）。
　　 左室收缩功能的评价:实验开始时，各组大鼠间FS和EF的变化均无显著差异(P＞0.05)。实验结束时，DM组与对照组比较，FS、LVEF均不同程度降低(P＜0.01-0.05);药物干预后的两组与DM组比较，FS、LVEF均不同程度升高(P＜0.01-0.05)。
　　 左室舒张功能的评价:实验开始时，各项指标均无显著差异(P＞0.05); DM组与对照组比较，第13w开始至21w实验结束时，E/A、E'/A'比值不同程度降低(P＜0.01-0.05); E/E'比值不同程度升高(P＜0.01-0.05);药物干预后的两组与DM组比较，E/A、E'/A'比值不同程度升高(P＜0.01-0.05)，E/E'不同程度降低(P＜0.01-0.05)。
　　 5.Millar导管测量各组左室功能指标的比较
　　 与对照组比较，DM组LVSP明显下降(P＜0.01)、LVEDP升高(P＜0.01)、±dp/dt max绝对值降低(P＜0.01-0.05)及Tau绝对值延长(P＜0.01)。与DM组比较:LVSP在大剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后明显升高(P＜0.05)，在两组DPP-Ⅳ抑制剂干预后，+dp/dt max(mmHg/s)均升高(P＜0.05)，LVEDP均显著下降(P＜0.05)，-dp/dt max(mmHg/s)绝对值均升高(P＜0.05)，左室松弛时间常数(Tau)绝对值不同程度缩短(P＜0.01-0.05)，大剂量药物干预组Tau缩短更显著。
　　 6.DM大鼠左室心肌重塑及DPP-Ⅳ抑制剂的影响
　　 6.1大体标本病理改变及HE染色
　　 DM组与对照组比较，心脏标本大体形态表现体积较大，HW/BW(mg/g)较大(P＜0.05);HE染色可见左室心腔扩大、室壁肥厚;细胞横截面积明显增加(498.37±14.31 vs347.84±12.27 um3，P＜0.01);HE染色可见，心肌细胞肥大，可见肌纤维排列紊乱、断裂现象，形态不规则，核大小不均。药物干预后的两组与DM组比较，心脏体积、HW/BW(mg/g)比值变小(P＜0.05）;左室心腔缩小，肥厚减轻;心肌细胞横截面积不同程度减少(P＜0.01-0.05); HE染色可见心肌细胞体积不同程度减小，细胞排列较规则、有序，核大小尚均一，高剂量药物组则改善更明显。
　　 6.2 DPP-Ⅳ抑制剂对DM心肌组织GLP-1含量、GLP-1R表达的影响
　　 实验结束时，Western-Blot提示:与对照组比较，DM组心肌组织GLP-1含量显著降低(P＜0.01)，GLP-1R表达也减少(P＜0.01）;药物干预后的两组与DM组比较，心肌组织GLP-1含量、GLP-1R表达均不同程度升高(P＜0.01-0.05)，提示DPP-Ⅳ抑制剂干预后，心肌组织内GLP-1含量升高，旦可提高GLP-1受体表达的密度。
　　 6.3 DPP-Ⅳ抑制剂减少DM心肌组织胶原的含量
　　 Masson染色所见:DM组与对照组大鼠比较，胶原纤维粗大，排列紊乱，分布不均，沉积增多;药物干预后的两组与DM组比较，沉积的心肌胶原减少，排列尚有序、分布也尚均匀。
　　 天狼猩红染色所见:DM组与对照组比较，心肌组织内胶原纤维较明显增加，排列紊乱，且可见不规则网状胶原纤维围绕在小动脉周围;药物干预后的两组与DM组比较，可见心肌组织胶原沉积减少。
　　 胶原含量比较:与对照组比较，DM组左室心肌组织胶原含量(15.86±0.43 vs7.06±0.31 ug/mg，P＜0.01)、胶原容积分数(CVF％)(4.8±0.49 vs0.47±0.06，P＜0.01-0.05)以及血管周围胶原面积/管腔面积比（PVCA/LA）(2.74±0.37 vs0.5±0.02，P＜0.01-0.05)均不同程度升高。药物干预后的两组与DM组比较，左室心肌组织胶原含量均不同程度减少。
　　 免疫组化染色:DM组心肌组织与对照组比较，Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性表达显著增加;不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后，可见心肌组织棕色颗粒不同程度减少。
　　 Western-Blot: DM组与对照组比较，心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达显著升高(P＜0.01），药物干预后的两组与DM组比较，均可见心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达不同程度降低（P＜0.01-0.05）。
　　 6.4 DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病大鼠心肌胶原酶MMP-1、9表达的影响
　　 免疫组化染色:DM组与对照组比较，MMP-1、9阳性表达显著增加。不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后，心肌组织棕色颗粒不同程度减少。
　　 Western-Blot.DM组与对照组比较，心肌组织MMP-1、9蛋白表达显著升高（P＜0.05），药物干预后的两组与DM组比较，心肌组织MMP-1、9表达均不同程度降低(P＜0.01-0.05)。
　　 6.5 DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病大鼠心肌组织炎性因子TNF-α、IL-6表达的影响
　　 免疫组化染色:对照组心肌细胞浆内见少量、稀疏的浅棕色颗粒;DM组心肌细胞胞浆内可见较多浓密深棕色颗粒。与DM组比较，不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后，可见心肌组织棕色颗粒分布散在、稀疏，有不同程度减少。
　　 Western-Blot:DM组与对照组比较，心肌组织TNF-α、 IL-6蛋白表达显著升高(P＜0.01），药物干预后的两组与DM组比较，心肌组织TNF-α、IL-6蛋白表达均下降（P＜0.05）。
　　 6.6 DPP-Ⅳ抑制剂减少DM心脏脂质的沉积
　　 油红O染色结果，与对照组比较，DM组心肌脂肪含量(7.03±0.31 vs0.32±0.01，P＜0.01)、心外膜脂肪组织含量(12.76±0.48 vs0.47±0.03，P＜0.01)均显著升高;药物干预后的两组与DM组比较，可见心肌组织脂肪含量、心外膜脂肪组织含量均呈不同程度减少(P＜0.01-0.05)。
　　 6.7糖尿病心肌组织RIP3的表达及DPP-Ⅳ抑制剂的干预
　　 免疫组化染色:DM组与对照组比较，RIP3棕黄色阳性颗粒表达增加，且分布在细胞核周围较多，不同剂量DPP-Ⅳ抑制剂干预后，细胞内棕黄色阳性颗粒表达不同程度减少。
　　 实时定量RT-PCR、Western-Blot检测:与对照组比较，DM组大鼠心肌组织RIP3 mRNA水平、蛋白水平表达均显著增高(P＜0.01);药物干预后的两组与DM组比较，RIP3 mRNA水平、蛋白水平表达均不同程度降低(P＜0.01-0.05)。
　　 6.8透射电镜观察DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病心肌细胞超微结构的影响
　　 DM心肌细胞核形状不规则，核固缩，染色质聚集，呈现凋亡细胞的早期表现;对照组心肌细胞核仁清晰可见，核膜光滑、完整。药物干预后的两组，细胞核未见明显染色质聚集，无核固缩表现，核膜尚完整、光滑。
　　 6.9 TUNEL染色观察DPP-Ⅳ抑制剂对糖尿病心肌组织细胞凋亡发生率的影响
　　 与对照组比较，DM组左室心肌组织凋亡细胞阳性率显著增加(P＜0.01)，药物干预后的两组与DM组比较，细胞凋亡发生率显著减少（P＜0.01）。
　　 6.10初步分析糖尿病心肌组织RIP3 mRNA表达与细胞凋亡率的相关性
　　 结合糖尿病心肌组织RIP3 mRNA表达与糖尿病心肌组织细胞凋亡百分率，初步分析糖尿病大鼠心肌组织RIP3 mRNA表达与细胞凋亡百分率的相关性，得知Pearson相关系数r=0.795(P＜0.001)，可以初步判断糖尿病大鼠心肌组织细胞凋亡百分率与RIP3 mRNA的表达呈显著正相关。
　　 研究结论:
　　 1.DPP-Ⅳ抑制剂影响DM心肌组织炎症反应、胶原代谢、脂质含量及心肌细胞凋亡的改变，逆转DM心肌病理性重塑;
　　 2.DM心肌组织中，RIP3表达上调，且与心肌组织细胞凋亡率呈显著正相关;DPP-Ⅳ抑制剂可干预DM心肌组织中RIP3过表达，抑制心肌细胞凋亡;
　　 3.DPP-Ⅳ抑制剂可显著降低DM大鼠左室E/E'，降低左室舒张末压(LVEDP)和-dp/dt max，增加LVEF和+dp/dt max，缩短Tau。显示DPP-Ⅳ抑制剂明显改善DM大鼠左心室收缩和舒张功能。