近红外光谱分析技术在肝素钠生产过程中的应用研究

摘要

肝素是糖醛酸和葡萄糖胺及它们的衍生物连接而成的具有不同链长的线性多糖，是开发最早、临床应用最广泛的糖胺聚糖类大分子药物。这类药物能够参与、影响和调控人体代谢和生理功能，临床上主要作为抗凝血药物。此外，它还具有调血脂、抗炎、抗过敏以及免疫调节等重要功能。肝素是我国最重要的生化原料药出口品种之一，占世界肝素原料药贸易份额高达87％。肝素的生产过程主要是指从肝素原料的评价开始一直到肝素成品入库的整个过程。在该过程中，多硫酸软骨素（OversulfatedChondroitinSulfate，OSCS）这一肝素结构类似物，能够引起严重的不良反应，应杜绝其掺入;肝素结构的完整性是保持其生物活性的基础，在生产中应尽量避免肝素结构的破坏;与肝素相结合的杂蛋白易产生过敏反应，生产过程中必须尽量去除;醇沉环节是影响肝素产品质量和收率的关键单元操作，应严格控制。因此，寻找精准质量控制方法可为保证肝素钠质量，保障广大人民的用药安全提供重要的技术支持。但实现精准控制的前提是对工艺过程的深刻理解，这就需要有效的过程分析技术做保证。
　　 近红外光谱分析技术（Near-infraredSpectroscopy，NIRS）作为一种快速、有效的过程分析方法，已经在化工等领域的过程分析中验证了其应用价值，但是在肝素钠等糖胺聚糖类药物过程分析中的应用还没有研究。
　　 本文以肝素钠的精制过程为研究对象，利用NIRS和化学计量学方法对肝素钠原料中的杂质OSCS及生产过程中离子交换、醇沉等关键单元操作的快速检测技术进行了研究，并针对肝素钠成品效价的测定进行了近红外光谱波段选择的研究。为近红外光谱法应用于肝素钠生产过程的质量控制奠定了理论基础。
　　 本课题研究内容及取得的主要成果有以下几个方面:
　　 1.NIRS用于肝素原料药中OSCS的快速检测方法研究
　　 本研究采用偏最小二乘β判别(PartialLeastSquaresBetaClassification，PLSBC)和K-最邻近距离算法(K-nearestNeighbor，KNN)两种模式识别方法分别对93份肝素钠原料药样品(47份不含有OSCS的精品肝素钠样品，46份含有OSCS的肝素钠样品)的近红外光谱进行了定性判别分析，分别选择34份不含有OSCS的精品肝素钠样品和34份含有OSCS的肝素钠样品建立定性分析模型，并利用剩余样品对模型进行验证。PLSBC验证结果表明当OSCS的含量大于0.7％时，可以有效地判别出含有OSCS的肝素钠样品。KNN验证结果表明所建KNN模型能够100％正确判别样品中是否含有OSCS。为进一步验证不同含量OSCS与不含有OSCS的精品肝素钠的关系，将不含有OSCS的精品肝素钠作为A等级，并根据OSCS含量的不同，将含有OSCS的肝素钠样品划分为5个含量等级，分别为B、C、D、E和F，OSCS含量等级判别时模型的判断正确率达83.33％。以上结果表明，运用NIRS可鉴别肝素钠样品中是否含有OSCS，这可为实际生产中原料药中是否含有OSCS提供可靠且快速的检测方法。
　　 2.NIRS用于快速监测粗品肝素离子交换层析过程的研究
　　 本研究选取肝素离子交换纯化过程流出液为对象，收集80份吸附过程样品和76份洗脱过程样品，采用偏最小二乘（PartialLeastSquares，PLS）算法分别建立吸附过程和洗脱过程流出液中肝素含量的NIRS定量分析模型。通过模型优化，最终选取光谱特征点8666cm-1、7160cm-1、5365cm-1建立吸附过程肝素含量定量分析模型，验证集预测均方根误差(RMSEP)=0.29g/L，验证集相关系数Rp=0.957，验证集标准偏差与预测标准偏差的比值RPD=3.4472;选取6098-5802cm-1这一波段范围建立洗脱过程肝素含量定量分析模型，RMSEP=3.55g/L，Rp=0.9647，RPD=3.9849。并按照样品批次将模型预测含量与参考值进行比较，肝素含量测定的参考值和近红外光谱模型预测值绘制的肝素含量变化趋势基本接近。所建方法具有快速、无损等优点，无需复杂的样品前处理，可直接对流出液样品进行检测，实现层析过程的实时跟踪。
　　 3.NIRS用于醇沉过程中肝素钠含量的测定研究
　　 本研究通过模拟肝素钠的醇沉过程，收集5批共80个醇沉过程样品，离心后取上清，采集上清的近红外光谱并测定其肝素含量。首先采用主成分分析(PrincipalComponentAnalysis，PCA)对醇沉过程进行光谱的特征性分析，不同批次之间主成分的变化趋势基本一致，第一主成分随着时间的推移得分不断的增加，揭示了乙醇量的不断增加;第二主成分可以较好的反应醇沉体系的稳定程度，开始向溶液中加入乙醇，肝素大量沉淀出来，体系的稳定性被破坏，在30-40min时，溶液中肝素的含量变化曲线出现拐点，主成分的得分也相应到达拐点;之后溶液中的肝素含量很低，体系又慢慢趋于稳定。结果表明通过PCA得分图的变化规律，可以很好地揭示整个肝素醇沉过程的变化趋势。其次，采用一阶导数SG15点平滑、交叉验证选取3个主成分数，在9034.87-8940.37cm-1、8649.17-8554.68cm-1、7974.21-7686.87cm-1、7395.67-7301.18cm-1以及5949.32-5758.4cm-1的波数范围建立肝素含量的PLS定量分析模型，绝对系数R2=0.974，交互验证均方根误差(RMSECV)=1.4089g/L，用建立的模型对结果进行预测，RMSEP=1.1054g/L。实验结果表明运用NIRS监测醇沉母液中肝素含量准确度和精密度均能满足工厂需要。
　　 4.肝素钠精品效价和近红外光谱之间的关联性研究
　　 本研究对47份效价分布范围在154-162IU/mg的肝素钠精品进行效价与近红外光谱之间的关联性探讨。通过对肝素钠精品的效价与近红外光谱建立PLS模型，预测肝素钠精品的效价，同时考察了相关系数法、间隔偏最小二乘法(intervalPLS，iPLS)、连续投影算法(SuccessiveProjectionsAlgorithm，SPA)三种波段选择方法对模型预测能力的影响以及吸光度、效价、结构之间的关系。结果表明相关系数法所选择的波段具有最佳的模型参数，Rp=0.8868，RMSEP=0.7925IU/mg，RMSECV=1.2786IU/mg。相关系数法选择的波段分布范围较广，涵盖C-H键振动的一级倍频、二级倍频、组合频，1800-2100nm的强烈吸收是由于O-H键的组合频引起，这些吸收区间均与肝素的结构有很大相关性，包含了肝素结构的诸多有效信息，因此相关系数法所选择的波段能产生最优的预测结果。
　　 本研究取得的主要创新性成果有以下几个方面:
　　 1.研究建立了利用近红外光谱结合PLSBC法和KNN法鉴别肝素钠原料药中OSCS的方法;
　　 2.研究建立了利用近红外光谱定量监测粗品肝素离子交换过程肝素含量分析方法;
　　 3.研究建立了利用近红外光谱定性和定量分析醇沉过程肝素钠含量变化的方法;
　　 4.对肝素钠精品效价和近红外光谱之间的关联性进行了研究，优化了近红外光谱定量分析肝素钠精品效价的模型。
　　 5.揭示了近红外光谱与肝素在不同体系中的关联规律，并研究了与不同物质之间的差异特征。

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摘要

符号说明

第一章 前言

1 肝素简介

1．1 肝素的结构及其性质

1．2 肝素精制过程

2 肝素生产中常用的检测技术

2．1 肝素原料的质量检测方法

2．2 肝素效价检测方法

2．3 肝素钠的蛋白质杂质测定技术

3 过程分析技术简介

4 近红外光谱分析技术简介

4．1 近红外光谱分析技术的定义

4．2 近红外光谱分析技术在制药领域的应用

4．3 近红外光谱分析技术在制药领域中定性、定量分析的基本规范

4．4 近红外光谱分析技术常用的化学计量学方法

5 本课题研究的目的与意义

6 本课题研究的主要内容

第二章 肝素原料中多硫酸软骨素快速检测方法研究

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 肝素钠精品制备

2．2 不同含量的OSCS肝素钠样品的制备

2．3 近红外光谱的采集

2．4 PLSBC鉴定模型的建立和验证

2．5 KNN判别模型建立

3 结果

3．1 肝素钠精品的制备结果

3．2 不同OSCS含量的肝素钠样品的制备结果

3．3 样品近红外光谱

3．4 PLSBC鉴定模型的结果

3．5 KNN鉴定模型的建立和验证

4 讨论

第三章 近红外光谱在粗品肝素纯化过程的应用研究

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2．方法

2．1 树脂的预处理

2．2 样品的制备

2．3 近红外光谱的采集

2．4 肝素含量的测定

2．5 数据处理

3．实验结果

3．1 肝素含量的测定

3．2 层析过程近红外光谱分析

3．3 层析过程近红外光谱定量分析模型的建立

4 讨论

第四章 肝素醇沉过程近红外光谱检测方法研究

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 样品制备

2．2 光谱的采集

2．3 UV分析

2．4 数据处理

2．5 模型评价

3 结果

3．1 UV测定分析

3．2 醇沉液中肝素钠含量

3．3 肝素钠醇沉母液的近红外光谱图

3．4 主成分分析光谱变化特征

3．5 醇沉过程定量分析模型的建立

4 讨论

第五章 肝素精品效价和近红外光谱的关联研究

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 肝素钠精品的收集

2．2 样品的制备

2．3 效价的测定

2．4 近红外光谱的采集

2．5 校正集、验证集样品的划分

2．6 模型的建立和验证

2．7 考查不同光谱预处理方法对模型的影响

2．8 考查不同光谱区域对模型的影响

3 结果

3．1 47份肝素钠精品的效价

3．2 47份肝素钠样品的吸收光谱

3．3 PCA得分图

3．4 校正集、验证集样品的划分

3．5 模型的建立和验证

3．6 考查不同光谱预处理方法对模型的影响

3．7 光谱区间的选择结果

4 讨论

第六章 总结与展望

1 全文总结

2 论文主要结论及讨论

3 创新点及突破的难点

4 展望及不足之处

参考文献

A method for identifying the origin of chondroitin sulfate with near infrared spectroscopy

Application of near-infrared spectroscopy combined with multivariate analysis in monitoring crude heparin purification Process

糖胺聚糖分子质量测定方法综述

一种鉴别硫酸软骨素来源的方法

一种心可舒制剂指纹图谱的测定方法

一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法

致谢

攻读学位期间发表的学术论文