海洋拟杆菌的富集培养与新物种鉴定

摘要

通过富集培养和16S rRNA基因序列的相似性比对、并构建系统发育树对威海近海小石岛沉积物和金海滩沉积物、福建近海二都蚶养殖区沉积物和漳州红树林沉积物可培养细菌的多样性进行了研究。用2216E和TSA培养基从威海近海小石岛沉积物和金海滩沉积物、福建近海二都蚶养殖区沉积物和漳州红树林沉积物中分别分离到117、135、15、15株细菌，通过形态学特征选择性筛选后，分别选取97、111、11、11株具有代表性的菌株进行了16S rRNA基因测序和基于16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明，小石岛沉积物97株细菌分别属于细菌域的4个大的系统发育类群(Actinobacteria， Bacteroidetes，Firmicutes，Proteobacteria)的25个科，42个属。其中拟杆菌门菌株FX10，FX11， FX12和XM4与相关模式菌株的16S rRNA基因相似度较低，初步推断这4株菌可能代表新的分类单元。从金海滩沉积物分离的111株细菌分别属于细菌域的4个大的系统发育类群（Actinobacteria， Bacteroidetes， Firmicutes，Groteobacteria）的31个科，51个属。其中拟杆菌门菌株FH2、FH4、FH5、FH6、FH7、FH8和KH2可能是新的海洋细菌。从福建近海二都邯养殖区富集培养液分离的11株菌分别属于细菌域的2个大系统发育类群(Bacteroidetes，Proteobacteria)中的3个科，4个属。从福建漳州红树林沉积物富集培养液分离的11株菌分别属于细菌域的4个大系统发育类群(Actinobacteria，Bacteroidetes， Firmicutes， Proteobacteria)中的4个科，7个属。海洋沉积物经富集培养3周后，2216E培养基分离到的疑似新物种细菌中拟杆菌门细菌是优势菌群。研究表明威海近海沉积物以及福建近海沉积物中的可培养细菌存在着较为丰富的物种多样性和系统发育多样性，并存在较多新的拟杆菌物种。
　　 在对金海滩沉积物分离到的细菌多样性研究中，基于16S rRNA基因序列分析，发现菌株FH5为拟杆菌纲(Bactero idia)的一个新科—龙细菌科(Draconibacteriaceae)，通过形态学、生理生化特征研究表明FH5为革兰氏阴性，兼性厌氧菌，无鞭毛，在2216E培养基上形成浅粉色菌落。最适生长条件是:28-33℃，pH6.5-7.5，1-5％(w/v) NaCl。 DNA(G+C)含量是44.2 mol％。主要脂肪酸有anteiso-C15:0，iso-C15:0，C17:1ω6c，anteiso-C17:0，Sum In Feature4(anteisoB/iso I-C17:1), C17:02-OH, iso-C16:03-OH, Sum In Feature1(C13:03-OH/15:1 i H)。细胞极性脂包括磷脂酰乙醇胺、胺脂质、磷脂质、脂质。基于以上研究，将FH5命名为命名为东方龙细菌(Draconibacterium orientalis)。模式菌株是FH5T(=DSM25947T=CICC10585T)，FH5T的16S rRNA基因序列的GenBank收录号是JQ683778。
　　 以同样的方法对实验室保存菌株HY2和HY3也进行了分类鉴定。HY2是革兰氏阴性、氧化酶阴性、兼性厌氧杆菌，无鞭毛。最适生长条件:28-33℃，pH7.2-8.4，0.5-4％(w/v)NaCl。细胞脂肪酸主要包括iso-C15:0，C15:0，C15:1ω6c，iso-C13:0, iso-C15:03-OH, iso-C17:03-OH, anteiso-C15:0, C15:03-OH, C16:03-OH, C16:0。基因组DNA(G+C)含量是45.9 mol％。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明HY2属于海洋滑动菌科Marinilabiliaceae，但是与目前已发表属的相似性＜91％。因此我们认为HY2应该代表一个新属，命名为黄色滑动菌属Flavilabilia。模式菌种是HY2T(=DSM24566T=CICC10658T)，命名为海洋黄色滑动菌Flavilabilia marina，16S rRNA基因序列的GenBank收录号是JQ683774。
　　 HY3是革兰氏阴性、无鞭毛的直杆状或略有弯曲的杆状菌。最适生长条件是30-35℃，pH6.5-8.0，0.5-3％(w/v) NaCl。HY3的主要醌类型是MK-7，脂肪酸是iso-C15:0, C15:0, iso-C15:03-OH, C15:1ω6c, anteiso-C15:0, iso-C17:03-OH,C15:03-OH,iso-C16:03-OH,C17:1ω6c,iso-C13:0,iso-C14:0,C16:03-OH。基因组DNA(G+C)含量是45.5 mol％。基于16S rRNA基因序列的相似性分析表明HY3属于海洋滑动菌科（Marinilab iliaceae）的黄色滑动菌属(Flavilabilia)的新种。基于形态学、生理生化和分子特征分析，我们认为HY3代表新种—威海黄色滑动菌Flavilabilia weihaiensis。模式菌种威海黄海黄色滑动菌Flavilabilia weihaiensis是HY3T(=DSM24567T)，16S rRNA基因序列的GenBank收录号是JQ683775。
　　 对发酵噬纤维菌Cytophaga fermentans分类地位进行修订，根据16S rRNA基因序列分析和生理生化特征分析，属于海洋滑动菌科（Marinilab iliaceae）新属。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 拟杆菌门微生物的研究现状

1．1．1 拟杆菌门的命名

1．1．2 拟杆菌纲微生物的分类

1．2 基于不同方法的拟杆菌门多样性研究现状

1．2．1 基于传统方法的拟杆菌门多样性研究

1．2．2 基于分子生物学技术的拟杆菌门多样性研究

1．3 海洋拟杆菌的分布及丰度

1．3．1 海洋拟杆菌的分布

1．3．2 海洋拟杆菌的丰度

1．4 海洋拟杆菌的生态学意义

1．4．1 海洋拟杆菌对有机质的降解

1．4．2 海洋拟杆菌的生态学功能

1．5 本论文研究的立项依据

第二章 海洋细菌的富集培养及分离

引言

2．1 实验材料和方法

2．1．1 培养基及主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 样品处理及菌株分离

2．2．3 菌株的分离纯化与保藏

2．2．4 细菌的培养特征观察

2．2．5 16S rDNA序列分析

2．3 结果与分析

2．3．1 细菌的分离及形态特征

2．3．2 威海小石岛沉积物可培养微生物类群的多样性

2．3．3 威海金海滩沉积物可培养微生物类群的多样性

2．3．4 福建近海二都蚶养殖区沉积物可培养微生物类群的多样性

2．3．5 福建漳州红树林沉积物可培养微生物类群的多样性

2．4 讨论

第三章 海洋拟杆菌深度分支—东方龙细菌(Draconibacterium orientalis)FH5的鉴定

引言

3．1 实验材料

3．1．1 材料

3．1．2 实验菌株及来源

3．2 实验方法

3．2．1 菌株FH5的16S rDNA序列测定和分析

3．2．2 菌株表型特征鉴定

3．2．3 菌株生理生化鉴定

3．2．4 菌株API快速鉴定

3．2．5 脂肪酸含量分析

3．2．6 DNA(G+C)mol％含量测定

3．2．7 醌和极性脂分析

3．2．8 DNA-DNA杂交分析

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株FH5形态特征

3．3．2 菌株FH5的生理生化特征

3．3．3 菌株FH5的脂肪酸含量

3．3．4 菌株FH5的DNA(G+C)mol%含量

3．3．5 菌株FH5的醌类型及极性脂分析

3．3．6 DNA-DNA杂交结果

3．3．7 菌株FH5 16S rdNA测序结果及分析

3．3．8 龙细菌科Draconibacteriaceae新科的描述

3．3．9 龙细菌属Draconibacterium新属的描述

3．3．10 东方龙细菌Draconibacterium orientalis新种描述

3．4 讨论

第四章 海洋拟杆菌新属新种——海洋黄色滑动菌Flavilabilia marina HY2的鉴定

引言

4．1 实验材料

4．1．1 培养基及主要试剂

4．1．2 实验菌株及来源

4．2 实验方法

4．2．1 菌株16S rDNA序列测定

4．2．2 菌株形态特征鉴定

4．2．3 菌株的基本生理生化鉴定

4．2．4 API鉴定系统

4．2．5 脂肪酸含量测定

4．2．6 DNA(G+C)mol％含量测定

4．2．7 菌株HY2的醌类型分析

4．2．8 极性脂分析

4．3 结果与分析

4．3．1 菌株HY2形态特征

4．3．2 菌株HY2的生理生化特征

4．3．3 菌株HY2的脂肪酸分析

4．3．4 菌株HY2的DNA(G+C)mol％含量

4．3．5 菌株HY2的醌类型分析

4．3．6 菌株HY2极性脂结果分析

4．3．7 菌株HY2 16S rDNA测序结果及分析

4．3．8 黄色滑动菌Flavilabilia新属的描述

4．3．9 海洋黄色滑动菌Flavilabilia marina新种的描述

4．4 讨论

第五章 海洋细菌新种威海黄色滑动菌Flavilabilia weihaiensis HY3的鉴定以及发酵噬纤维菌Cytophaga fermentans分类地位修订

引言

5．1 实验材料

5．1．1 培养基及主要试剂

5．1．2 实验菌株及来源

5．2 实验方法

5．2．1 实验菌株16S rDNA鉴定

5．2．2 菌株形态特征鉴定

5．2．3 菌株经典生理生化鉴定

5．2．4 API鉴定系统

5．2．5 脂肪酸含量测定

5．2．6 菌株DNA(G+C)mol％含量测定

5．2．7 醌及极性脂类型分析

5．3 结果与分析

5．3．1 菌株HY3和DSM 9555的表型特征

5．3．2 菌株HY3和DSM 9555生理生化特征

5．3．3 菌株HY3和DSM 9555的脂肪酸含量分析

5．3．4 菌株HY3 DNA(G+C)mol％含量分析

5．3．5 菌株HY3的醌类型分析

5．3．6 菌株HY3和DSM 9555极性脂结果分析

5．3．7 HY3和DSM 9555 16S rDNA测序结果及分析

5．3．8 威海黄色滑动菌Flavilabilia weihaiensis新种的描述

5．4 讨论

结论与展望

参考文献

致谢

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