结缔组织生长因子(CTGF)对人牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响

摘要

全世界牙周病的发病率约为10％～15％。最新结果统计显示，在我国及日本30岁以上人群中有约80％人患牙周病[1]。牙周病成为35岁以上人群牙齿缺失的主要原因，并已成为多种慢性系统性疾病（如冠心病、糖尿病等）发生、发展的危险因素，严重威胁着人类的健康[2]。牙周病治疗的最终目标是重建因炎症过程而破坏的牙周组织，恢复其正常的结构和功能，即真正实现牙周组织的再生。但因牙周病丧失的牙周组织，其重建与修复的难度很大。多年来，人们一直在寻求能有效增加牙周新附着、促进牙周组织再生的方法，并开展了引导牙周组织再生、牙周骨移植技术等多方面的研究，取得了一定进展，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远远未达到所期望的目标。近年来，组织工程、干细胞及其相关技术的发展突飞猛进，采用组织工程技术再生组织或者器官的研究也方兴未艾，这为牙周组织再生研究提供了契机。组织工程学的研究重点主要在于以下三个方面:(1)种子细胞的来源;(2)生物载体支架材料的选择;(3)有效的细胞因子。所以选择有效的细胞因子是运用组织工程技术获得牙周再生的先决条件。
　　结缔组织生长因子(CTGF)是近年来出现的一类促进组织修复的细胞生长因子，可以促进有丝分裂和细胞增殖，趋化细胞，诱导细胞黏附和细胞外基质的合成。已经在眼科、肝肾等学科中进行了深入研究，但在口腔科中很少涉及。牙周支持组织中也含有大量的纤维组织，牙周膜成纤维细胞是牙周组织中最重要的功能细胞，而CTGF与牙周组织的成纤维细胞的关系研究很少。
　　本课题选取人双尖牙根中1/3的牙周膜组织进行体外培养，通过组织块培养法提取人牙周膜成纤维细胞，提取成功后用结缔组织生长因子作用于成纤维细胞，观察对其生物学活性的影响，从而为口腔科治疗牙周病提供新的研究方向，为牙周病临床药物的研发提供新的生长因子。
　　目的:
　　体外培养人牙周膜成纤维细胞作为研究对象，观察不同浓度的结缔组织生长因子(CTGF)对人牙周膜成纤维细胞增殖、分化、黏附、迁移、合成细胞外基质的影响，探讨不同浓度的结缔组织生长因子(CTGF)对人牙周膜成纤维细胞的生物学变化及其意义，为牙周组织再生的深入研究提供实验依据。
　　方法:
　　1、在体外利用组织块培养法分离纯化人牙周膜成纤维细胞，倒置相差显微镜和苏木素-伊红染色观察细胞形态，绘制细胞生长曲线，对细胞进行免疫细胞化学鉴定。
　　2、应用CCK-8方法检测不同浓度的结缔组织生长因子(1、5、10、50、100ng/ml)作用于人牙周膜成纤维细胞24、48、72h后增殖活性的影响。
　　3、应用碱性磷酸酶试剂盒检测不同浓度的结缔组织生长因子(1、5、10、50、100ng/ml)对人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响。
　　4、应用羟脯氨酸试剂盒检测不同浓度的结缔组织生长因子(1、5、10、50、100ng/ml)对人牙周膜成纤维细胞合成胶原蛋白的影响。
　　5、应用茜素红染色法检测不同浓度的结缔组织生长因子(1、5、10、50、100ng/ml)对人牙周膜成纤维细胞形成矿化结节能力的影响。
　　6、应用Transwell小室检测不同浓度的结缔组织生长因子(1、5、10、50、100ng/ml)对人牙周膜成纤维细胞迁移能力的影响。
　　7、应用实时定量PCR的方法检测不同浓度的结缔组织生长因子(1、5、10、50、100ng/ml)对人牙周膜成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）、碱性磷酸酶(ALP)、纤维连接蛋白(FN)、骨涎蛋白(IBSP)、骨钙素(OC)、整合素β1(ITGB1)mRNA水平的影响。
　　所有实验数据均采用SPSS20.0统计软件进行分析，数据结果均以均数±标准差（(x)±s）表示，以P＜0.05认为具有统计学意义。
　　结果:
　　1、在体外采用组织块培养法成功获取人牙周膜成纤维细胞。细胞形态正常，形状稳定，状态良好。免疫细胞化学染色波形丝蛋白阳性，角蛋白阴性，符合中胚层来源的间充质细胞的特征，证明培养的细胞是人牙周膜成纤维细胞。细胞生长曲线呈现“S”形。处于对数生长期的人牙周膜成纤维细胞，活性最佳，生长旺盛，最适合用于实验研究。本实验取第4～6代细胞进行后续实验。
　　2、与对照组相比，1、5、10ng/ml的CTGF在24、48、72h对人牙周膜成纤维细胞有明显的促增殖作用，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而50ng/ml的CTGF与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，100ng/ml的CTGF则对人牙周膜成纤维细胞有抑制作用。两两比较显示，不同浓度的CTGF刺激人牙周膜成纤维细胞增殖在三个不同的时间点之间，差异没有统计学意义(P＞0.05)。10ng/ml为促进人牙周膜成纤维细胞增殖的最佳浓度。
　　3、与对照组相比，1、5、10、50ng/ml的CTGF在7、14、28d对人牙周膜成纤维细胞有显著增强ALP活性的作用，差异具有统计学意义(P＜0.05)，100ng/ml的CTGF则对人牙周膜成纤维细胞ALP活性有抑制作用。两两比较显示，不同浓度的CTGF增强人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶的活性在三个不同的时间点之间，差异没有统计学意义(P＞0.05)。10ng/ml的CTGF为促进人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的最佳浓度。
　　4、与对照组相比，1、5、10ng/ml的CTGF对人牙周膜成纤维细胞有显著增强胶原蛋白合成的作用，差异具有统计学意义(P＜0.05)，50、100ng/ml的CTGF与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。10ng/ml的CTGF为促进人牙周膜成纤维细胞合成胶原蛋白的最佳浓度。
　　5、6个实验组之间矿化率比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与对照组相比，在质量浓度10ng/ml时，CTGF具有最大的促矿化作用(P＜0.01)。
　　6、1～100ng/ml的结缔组织生长因子可以明显促进人牙周膜成纤维细胞迁移，差异具有统计学意义(P＜0.05)。细胞迁移能力随着结缔组织生长因子(CTGF)浓度的增高而增加，表现出明显的浓度依赖性。
　　7、RT-PCR结果显示，细胞ALP的mRNA表达水平，在CTGF浓度为5、10、50ng/ml时可以促进ALPmRNA的表达，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，在10ng/ml时达到最高峰。而1ng/ml和100ng/ml时与对照组相比差别不大。细胞IBSP的mRNA表达水平，在CTGF浓度为1、10、50、100ng/ml时可以促进IBSPmRNA的表达，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，在10ng/ml时达到最高峰。而5ng/ml时与对照组相比差别不大。细胞OC的mRNA表达水平，在CTGF浓度为1、10、50ng/ml时，可以促进OCmRNA的表达，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，在10ng/ml时达到最高峰。而5ng/ml和100ng/ml时与对照组相比差别不大。细胞FN、COL-Ⅰ的mRNA表达水平，当CTGF在一定的浓度范围(1～100ng/ml)内可以促进FN、COL-Ⅰ的mRN的表达，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，在10ng/ml时达到最高峰。细胞ITGB1的mRNA表达水平，在CTGF浓度为1、5、10、50ng/ml时可以促进ITGB1mRNA的表达，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，在10ng/ml时达到最高峰。而100ng/ml时与对照组相比差别不大。
　　结论:
　　1、在体外采用组织块培养法可以成功获取人牙周膜成纤维细胞。该方法简单易行，结果可靠，可以作为体外人牙周膜成纤维细胞实验的研究模型。
　　2、结缔组织生长因子作用于人牙周膜成纤维细胞以后，能够提高人牙周成纤维细胞的活性，通过提高整合素β1亚单位的表达来促进其黏附，促进人牙周膜成纤维细胞增殖、迁移并参与细胞外基质的调节，促使人牙周膜成纤维细胞向成骨细胞分化，促进牙周支持组织再生。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

实验一 人牙周膜成纤维细胞的分离和培养

材料与方法

结果

讨论

实验二 结缔组织生长因子(CTGF)对人牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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