联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

摘要

背景与目的:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率呈增高趋势，目前临床常用的治疗方式如手术切除或肝动脉栓塞化疗术，往往效果欠佳且难以治愈。应用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术降低肿瘤细胞基因表达，从而改变肿瘤的生物学效应，是目前肿瘤治疗研究的重要方式，为HCC的分子靶向治疗提供理论基础。Livin和Survivin都是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成员，在HCC HepG2细胞中的表达量较正常肝细胞高，且均通过IAP重复结构域(baculovirus-IAP repeat，BIR)发挥凋亡抑制作用，二者在HepG2细胞凋亡抑制的调控中可能具有协同作用。因此，通过联合抑制HepG2细胞中两种基因的表达，以诱导HepG2细胞凋亡，其效果可能优于单一基因抑制。本研究构建Livin及Survivin shRNA真核表达载体，应用RNAi技术，分别联合或单独抑制HepG2细胞中Livin和Survivin基因的表达，以研究联合或单独的基因抑制对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响及差异。
　　方法:分别设计、构建靶向Livin或Survivin的shRNA真核表达载体，即pSD11-Livin和pSD11-Survivin，脂质体法单独或联合转染HepG2细胞，分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和联合转染组。荧光定量PCR(fluorescence quantitive PCR，FQ-PCR)、western blot分别检测HepG2细胞Livin和Survivin的mRNA及蛋白的相对表达量，MTT法、TUNEL法分别检测HepG2细胞增殖和细胞凋亡的变化。应用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析，统计量以均数±标准差表示。应用单因素方差分析和Turky检验进行统计学意义评估，P＜0.05具有统计学意义。
　　结果:靶向Livin、Survivin的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染组HepG2细胞的Livin、Survivin mRNA相对表达量与单独转染组相比均显著降低;联合转染组HepG2细胞的Livin、Survivin蛋白相对表达量与单独转染组相比均具有统计学差异。与单独转染组相比，联合转染组细胞生长抑制率于转染后48h、60h、72h均显著增高，细胞凋亡率明显上升。
　　结论:1.Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达相互独立，单独抑制IAP家族中一种基因的表达可能不会引起该家族其他基因表达量的改变;
　　2.与单一基因抑制相比，联合转染Livin和Survivin基因表达载体可以更有效的降低Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达，Livin、Survivin基因在抗凋亡作用机制上可能存在协同;
　　3.联合抑制HepG2细胞Livin和Survivin的表达可更有效的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩写及符号说明

前言

1．凋亡抑制蛋白在肝细胞肝癌的研究进展

2．肝细胞肝癌的治疗研究中RNAi的应用意义与实用价值

3．基于RNA干扰技术，联合抑制肝癌细胞IAP表达的理论及实验基础

材料与方法

1．主要材料

2．试剂配制

3．实验仪器与耗材

4．实验步骤

5 统计学分析

结果

1．Livin、survivin shRNA真核表达载体的鉴定

2．实时荧光定量PCR检测细胞mRNA的表达

3．western blot检测细胞蛋白的表达

4．MTT法检测细胞生长抑制率

5．TUNEL技术检测细胞凋亡

讨论

结论

参考文献

综述 MicroRNA在肝细胞肝癌的临床应用前景

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文