塞来昔布诱导喉癌Hep-2细胞凋亡及细胞周期阻滞的实验研究

摘要

研究背景:喉癌在头颈部是一种比较常见的恶性肿瘤，近十年来其发病率有逐年升高的趋势。其传统治疗方法是手术切除，并根据患者情况辅助放疗或化疗。根据临床分期及病理分级，采取手术和（或）化疗及化疗联合放疗的综合治疗，被认为是喉癌治疗的理想方案。合理的化疗和（或）化疗联合放疗对于晚期及复发型喉癌病人总生存率、器官保留较传统手术都有提高。选择一种副作用小且有效的化疗药物在喉癌综合治疗中有重要作用。近十年来环氧化酶-2(COX-2)作为新的肿瘤治疗靶点成为肿瘤研究的热点，塞来昔布作为其特异性抑制剂，最初被美国FDA批准治疗疼痛，近年来发现其可以诱导包括消化道肿瘤在内的多种肿瘤细胞发生凋亡，抑制肿瘤生长，但塞来昔布在喉癌的临床应用和基础研究报道均较少。本研究，针对环氧化酶-2在人喉癌细胞系Hep-2细胞中的表达，及塞来昔布诱导Hep-2细胞凋亡和细胞周期阻滞进行初步研究，为探讨喉癌化疗敏感性提供理论依据。
　　目的:
　　1.探讨COX-2在喉癌Hep-2细胞系中的表达及塞来昔布对COX-2表达的影响;
　　2.初步探讨塞来昔布诱导Hep-2细胞凋亡及可能的机制。
　　3.初步探讨塞来昔布诱导Hep-2细胞周期阻滞及可能的机制。
　　方法:
　　以不同浓度的塞来昔布处理喉癌Hep-2细胞，以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖活力的影响;Hoechst33342对细胞进行染色，荧光显微镜下观察细胞核的形态改变;Annexin Ⅴ/PI双染以流式细胞仪检测细胞的凋亡率;透射电镜观察塞来昔布处理后的细胞超微结构改变;JC-1染色，荧光显微镜下观察细胞线粒体膜电位的改变;Western blot检测:Bcl-2、Bax及COX-2的表达，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinaseinhibitor;CKI)P16INKa、P21waf/cip1、P27KIP的表达，以及分析Caspase-3、PARP裂解和AIF从线粒体释放到细胞核。
　　结果:
　　1.COX-2在喉癌Hep-2细胞系中存在表达且其表达受塞来昔布抑制。
　　2.MTT结果显示塞来昔布在10-100μmol/L浓度范围可抑制Hep-2细胞的增殖活力，并呈时间和浓度依赖性。Hoechst33342染色及电镜结果可见镜下典型凋亡的形态改变;流式细胞仪结果显示Hep-2细胞凋亡率随塞来昔布浓度增加而升高。
　　3.流式细胞仪分析细胞周期分布可见细胞周期阻滞于G0/G1期。
　　4.JC-1染色可知，随着塞来昔布处理时间的延长，线粒体膜电位逐渐下降。
　　5.western blot结果见:随着塞来昔布浓度的升高，Bax/Bcl-2蛋白比值升高，P16INK4a、P27KIP表达增加，P21waf/cip1表达无明显改变;随着塞来昔布处理时间的延长，caspase-3蛋白、PARP蛋白逐渐出现裂解片断，AIF蛋白逐渐从线粒体释放移位到细胞核。
　　结论:
　　塞来昔布抑制肿瘤细胞增殖活性机制可能与其诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞有关。塞来昔布抗肿瘤活性可能与COX-2途径有部分联系，是一种有前景的喉癌化疗药物。