急性髓系白血病TFPI-2基因表达及启动子甲基化的研究

摘要

背景：近年来研究表明，DNA甲基化尤其是抑癌基因的高甲基化所致失表达在白血病的发生、发展、诊断及其预后方面有重要作用。组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因是一种带有Kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员，可通过影响细胞外基质的重塑参与组织发生、伤口愈合、血管生成、肿瘤的侵袭转移等生理病理过程。TFPI-2作为一种抑癌基因，在非小细胞肺癌、肝细胞癌、前列腺癌等人类多种肿瘤中由于启动子甲基化而沉默，从而使其抑制细胞生长及促进细胞凋亡的作用丧失。目前有关急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者TFPI-2甲基化的相关研究国内外报道较少，TFPI-2甲基化与AML发生及发展的关系尚不明确。本研究检测AML患者在初诊、缓解及复发/难治阶段TFPI-2基因的表达情况，TFPI-2启动子区域CpG岛的甲基化状态，结合患者临床特征，以探讨TFPI-2基因在AML中的临床意义。
　　第一部分TFPI-2基因在急性髓系白血病的表达改变
　　目的：检测TFPI-2基因在AML患者骨髓单个核细胞中的表达水平，以初步了解TFPI-2基因在AML中的作用，探讨其与AML发生、发展及危险度分层及预后的关系。
　　方法：
　　1.分离33例初治、19例完全缓解、12例复发/难治AML患者及15例单纯缺铁性贫血患者（对照组）骨髓单个核细胞，采用实时定量PCR检测TFPI-2mRNA在其中的表达水平，分析TFPI-2表达与AML患者临床特征的关系。
　　2.将初治AML患者按化疗效果分为完全缓解组(CR)和未完全缓解组（包括PR和NR），用Mann-Whitney U检验比较两组间TFPI-2mRNA的表达水平。
　　3.应用SPSS17.0软件进行统计学分析处理，实时定量资料属于非正态计量资料，数据用中位数和范围表示，多组间TFPI-2mRNA表达水平的比较采用Kruskal-Wallis检验，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，P＜0.05为具有统计学意义。
　　结果：
　　1.AML各组与对照组中TFPI-2mRNA的表达初治组、完全缓解组及复发/难治组AML患者TFPI-2mRNA表达水平均低于对照组（P均＜0.05）;复发/难治组TFPI-2mRNA表达水平明显低于初治组(P=0.006);与完全缓解组相比，初治组TFPI-2mRNA表达水平也显著降低(P=0.030)。
　　2.TFPI-2的表达水平与临床疗效的关系初治组经2个疗程化疗后，完全缓解组(CR)骨髓单个核细胞TFPI-2mRNA表达量显著高于未完全缓解组(PR+NR)(P=0.031)。23例获完全缓解AML患者缓解后骨髓中TFPI-2mRNA中位表达水平显著高于化疗前(P=0.044);10例未获完全缓解AML患者2个标准化疗后骨髓中TFPI-2mRNA中位表达水平与治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3.TFPI-2mRNA表达水平与AML病程的关系本研究对4例初治AML患者进行随访，其中例1、例2患者化疗前TFPI-2水平低表达，化疗后患者达CR后TFPI-2水平转为高表达，并处于持续CR状态。例3患者TFPI-2表达维持在较低水平，最终因治疗无效而死亡。例4患者化疗后达CR，TFPI-2表达持续高水平，于治疗第5个月TFPI-2mRNA的表达水平明显降低，该患者于1个月后出现白血病复发。
　　4.TFPI-2基因mRNA表达水平与AML患者临床特征间的关系TFPI-2基因的mRNA表达水平与AML患者年龄、性别、初诊时白细胞数、FAB分型及染色体核型均无相关性(P＞0.05)。
　　结论：
　　1.初治组、复发/难治组及完全缓解组AML患者骨髓单个核细胞中TFPI-2表达水平均低于对照组（P均＜0.05），提示TFPI-2表达水平降低与AML的发生及预后密切相关。
　　2.AML患者经治疗后获完全缓解者，其TFPI-2表达水平较未完全缓解者明显升高，提示TFPI-2高表达者，完全缓解率高，TFPI-2与AML的治疗预后相关;AML患者完全缓解后，其TFPI-2表达水平较治疗前明显升高，进一步说明TFPI-2的表达水平与AML患者的病情进展有关。
　　3.治疗前TFPI-2低表达的AML患者经化疗获CR后TFPI-2的表达水平可升高;未能获得CR者，TFPI-2的表达维持在较低水平;获得CR的AML患者在复发前，出现TFPI-2表达水平的升高后再次降低，因此，通过检测AML患者TFPI-2的表达水平，对发现AML的早期复发及判断预后有一定意义。
　　4.TFPI-2基因表达水平与患者年龄、性别、初诊时白细胞数、FAB分型及染色体核型均无显著相关性。提示TFPI-2的表达可能是一项独立于这些临床特征的预后相关因素。
　　第二部分急性白血病TFPI-2基因启动子甲基化状态的检测及分析
　　目的：检测AML患者TFPI-2基因启动子CpG岛甲基化状态。分析其与TFPI-2表达下调的关系，以进一步探讨其与AML发生、预后的关系。
　　方法：
　　1.分离33例初治、19例完全缓解、12例复发/难治AML患者（对照组）骨髓单个核细胞，采用甲基化特异性PCR检测启动子CpG岛甲基化状态，15例单纯缺铁性贫血患者作为对照组。
　　2.应用SPSS17.0软件进行统计学分析处理，计数资料之间的差异比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为具有统计学意义。
　　结果：
　　1.64例AML患者TFPI-2基因启动子甲基化频率为64.63％(42/64)，其中初治组、完全缓解组和复发/难治组患者中TFPI-2基因启动子甲基化频率分别为66.67％(22/33)、52.63％(10/19)和83.33％(10/12)，各组间比较无统计学意义(P＞0.05)。对照组骨髓单个核细胞中未检测到TFPI-2基因启动子的甲基化。
　　2.甲基化AML患者与非甲基化AML患者骨髓单个核细胞中TFPI-2mRNA的相对表达量分别是0.165(0.005-2.099)和0.597(0.011-2.787)，两组间比较有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.TFPI-2基因甲基化与AML患者临床特征间的关系TFPI-2基因的甲基化状态与AML患者年龄、性别、初诊时白细胞数、血红蛋白、血小板、FAB分型、染色体核型及诊断分期均无相关性(P＞0.05)。
　　结论：
　　1.AML患者TFPI-2基因启动子甲基化频率为64.63％(42/64)，且难治组AML患者TFPI-2甲基化频率明显高于初治组和完全缓解组，差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组骨髓单个核细胞中未检测到TFPI-2基因启动子的甲基化。提示TFPI-2基因启动子的异常甲基化可能与AML的发病密切相关，其甲基化程度升高和表达降低均预示着预后不良，该指标的监测对AML预后判断及化疗方案的选择有一定意义。
　　2.甲基化阳性患者中TFPI-2基因表达水平明显低于非甲基化患者(P＜0.05)，提示其启动子CpG岛的异常甲基化可能是导致TFPI-2基因表达下降甚至沉默的主要原因之一。
　　3.TFPI-2基因启动子甲基化频率与患者年龄、性别、初诊时白细胞数、血红蛋白、血小板、FAB分型及染色体核型均无显著相关性。提示TFPI-2的甲基化状态可能是一项独立于这些临床特征的预后相关因素。