柚皮素通过激活Nfr2/ARE信号通路对6-OHDA致帕金森性神经损伤的保护作用

摘要

[研究背景]：
　　帕金森病(Parkinson's disease，PD)发病机制复杂，其典型病理特征是黑质致密体部位多巴胺能神经元选择性损伤和丢失。越来越多的研究表明，氧化应激是帕金森病发病的重要诱因，因此通过降低氧化应激反应是帕金森病的一个新的重要治疗策略。
　　Nrf2（nuclea rfactorerythroid-2related factor2）是调节细胞氧化还原平衡的重要转录因子。作为体内最重要的内源性抗氧化通路，Nrf2/ARE信号通路的激活可诱导一系列与抗氧化有关的具有多重细胞保护作用的基因表达。在对抗氧化应激损伤方面具有很大潜力。转录因子Nrf2转移入核后启动受ARE调控的基因转录，使血红蛋白氧合酶(HO-1)、谷胱甘肽半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、谷胱甘肽半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)等表达水平增高，以此来维持细胞内氧化还原状态的平衡和降低氧化损伤。
　　众多的证据表明，Nrf2-ARE通路在PD病理过程中发挥重要作用，是PD发生发展过程中重要的调控靶点。寻找新型高效的Nrf2诱导剂可为PD的治疗提供新的有效候选药物。我们的前期研究发现，青兰属药用植物岩青兰中含有的黄酮类成分柚皮素为强Nrf2诱导剂，初步细胞实验发现该化合物可保护6-OHDA所致SH-SY5Y细胞氧化应激损伤，且此保护作用与Nrf2-ARE通路诱导密切相关。本研究通过6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞模型及C57BL/6小鼠PD模型，分别从体内体外研究该化合物对6-OHDA所致PD细胞及动物模型的保护作用及机制，从抗氧化角度阐明其作用机理。为PD的治疗提供一种新策略，为筛选Nrf2-ARE通路诱导剂治疗PD疾病提供新思路和途径。
　　[研究目的]：
　　研究柚皮素通过调控Nrf2/ARE通路对6-OHDA所致PD细胞及帕金森病小鼠氧化应激损伤的神经保护作用及作用机制。
　　[研究方法]：
　　体外实验:
　　1.在SH-SY5Y细胞中给予不同浓度的柚皮素干预，用Westernblot检测Nrf2蛋白表达，在干预24h后检测下游蛋白(GCLC，GCLM，HO-1)的表达水平。检测柚皮素是否可激活Nrf2-ARE信号通路。给予不同浓度柚皮素(40μM、80μM)干预24h后检测细胞内GSH的合成。
　　2.在SH-SY5Y细胞中给予不同浓度的柚皮素干预2h后，再给予6-OHDA损伤24h。用MTT法检测细胞存活率，Hoechst33258染色检测细胞凋亡水平，化学显色法检测SH-SY5Y细胞内LDH的含量，荧光染色法检测SH-SY5Y细胞内ROS的产生，检测柚皮素对6-OHDA所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。
　　3.在SH-SY5Y细胞中给予不同浓度的柚皮素干预2h后，再给予6-OHDA损伤24h。用Westernblot检测凋亡通路各蛋白(p-JNK，p-p38，caspase-3)的表达水平，检测柚皮素是否可以阻断6-OHDA所致JNK/p38凋亡信号通路的激活。
　　4.si-RNA干扰Nrf2表达，用柚皮素干预2h后，Westernblot检测Nrf2蛋白表达，在干预24h后用Westernblot的方法检测下游蛋白(GCLC，GCLM，HO-1)的表达水平。检测Nrf2被干扰后柚皮素是否还可以激活Nrf2-ARE通路。
　　5.si-RNA干扰Nrf2表达，用柚皮素干预2h后，再给予6-OHDA损伤24h，用Westernblot检测凋亡通路各蛋白（p-JNK，p-p38，caspase-3）的表达水平，检测Nrf2被干扰以后，柚皮素是否还可以阻断6-OHDA所致JNK/p38凋亡信号通路的激活。
　　6.用si-RNA干扰Nrf2表达，用柚皮素干预2h后，再给予6-OHDA损伤24h。用MTT法检测细胞存活率，检测Nrf2被干预后，柚皮素的保护作用是否还存在，以验证柚皮素的保护作用是否通过激活Nrf2-ARE通路实现。
　　体内实验:
　　1.C57BL/6小鼠灌胃给予柚皮素干预5天后，分别取不同脑区及不同时间点的纹状体，用Westernblot检测不同脑区及不同时间点Nrf2及下游蛋白(GCLC，GCLM，HO-1)表达水平。
　　2.C57BL/6小鼠灌胃给予柚皮素干预5天后，以立体定位注射的方法在C57BL/6小鼠纹状体内注射6-OHDA进行PD模型建造。分别在7d，14d和21d检测阿扑吗啡诱导的动物行为学改变。
　　3.分别于造模后1d和7d取小鼠脑组织，测检测纹状体内GSH的合成和ROS的产生。
　　4.造模7d后处死小鼠，用Westernblot检测凋亡通路各蛋白(p-JNK，p-p38，caspase-3)的表达水平，检测柚皮素是否可阻断6-OHDA所致纹状体内JNK/p38凋亡信号通路的激活。
　　5.造模21d后，用HPLC法检测C57BL/6小鼠纹状体内DA及其代谢产物DOPAC、HVA的含量，免疫组化和Westernblot检测纹状体及黑质内TH的表达，观察检测柚皮素是否可减轻6-OHDA所致小鼠PD模型脑内多巴胺神经元的缺失。
　　[实验结果]：
　　1.柚皮素可呈浓度及时间依赖性诱导SH-SY5Y细胞中Nrf2蛋白表达，并促进Nrf2下游蛋白如GCLC、GCLM及HO-1的表达。
　　2.柚皮素可增加SH-SY5Y细胞中GSH的合成及降低6-OHDA所致细胞内ROS水平的升高，并且成浓度依赖性。
　　3.柚皮素可呈时间依赖性诱导C57BL/6鼠纹状体内Nrf2蛋白表达，并促进Nrf2下游蛋白如GCLC、GCLM及HO-1的表达。
　　4.柚皮素可诱导C57BL/6小鼠纹状体和黑质致密体部位Nrf2蛋白表达，并促进Nrf2下游蛋白如GCLC、GCLM及HO-1的表达。
　　5.柚皮素可增加C57BL/6小鼠纹状体内GSH合成及降低6-OHDA所致脑内ROS水平的升高。
　　6.柚皮素可减轻6-OHDA所致SH-SY5Y细胞凋亡;减轻PD模型小鼠脑内多巴胺神经元的缺失，改善阿扑吗啡诱导的行为学。
　　7.Nrf2-ARE信号通路被阻断以后，柚皮素的神经保护作用消失。
　　[结论]：
　　柚皮素对6-OHDA所致PD小鼠具有神经保护作用，而且此保护作用是通过激活Nrf2-ARE信号通路实现。