活化素受体样激酶7与糖尿病心肌病关系的实验研究

摘要

背景
　　糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，DCM)是一种独立于糖尿病大血管并发症的心肌结构和功能改变的疾病，与糖尿病特有的代谢异常相关，以左室舒张和/或收缩功能障碍为主要的临床表现，是糖尿病患者高心力衰竭发生率和高死亡率的主要原因。糖尿病心肌病的主要病理变化包括细胞肥大、凋亡、变性、坏死和心肌间质的纤维化。心肌细胞凋亡是DCM发生发展的重要病理生理机制，心肌细胞凋亡在DCM进程中的作用为:1.减少心肌细胞数量，使心肌收缩单位逐步减少，导致心脏收缩功能障碍;2.由于心肌收缩单位减少，促进心肌细胞代偿性增生，引起心室肥厚及心脏重构，导致心脏舒张功能不全。
　　Smad2/3在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，是调控细胞增殖分化非常重要的信号分子。研究表明，多种刺激如活化蛋白-1、血管紧张素和一氧化氮均可激活Smad2/3，活化的Smad2/3与Smad4结合后形成异源寡聚物转移到细胞核内，激活凋亡相关基因如caspase-3/6/9等的转录，从而引起细胞凋亡，然而Smad2/3在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用仍不清楚。
　　ALK7是Ⅰ型活化素(Activin)受体家族新成员，它是有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞膜孤儿受体，由跨膜区、丝氨酸/苏氨酸激酶区和两者之间的GS区及胞外配体结合区组成，目前已知配体有和生长/分化因子3、Nodal、ActivinAB和ActivinB。在信号转导过程中上述配体首先和Ⅱ型Activin受体结合，而后ALK7和它们形成复合物，其GS区被Ⅱ型Activin受体磷酸化，激酶区则使受体激活型Smad2/3磷酸化，进而通过Smads信号通路参与细胞粘附、增殖、分化、凋亡等的调控。ALK7在人胰脏、脑组织、脂肪组织、肝脏、肠道和心脏中均有表达，现有研究证实，ALK7介导下游促凋亡信号通路参与人卵巢上皮细胞、肝癌细胞、胰岛细胞的增殖凋亡的调控，但ALK7在心肌细胞凋亡中的作用仍不清楚。结合上述研究，本课题将探讨ALK7-Smad2/3信号转导通路在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用。
　　目的
　　1.探讨高糖对心肌细胞凋亡的影响;
　　2.探讨Smad2/3在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用;
　　3.探讨高糖对心肌细胞ALK7表达水平的影响;
　　4.探讨ALK7在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用及其信号转导机制。
　　材料方法
　　本研究以H9c2大鼠心肌细胞系及原代培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象，应用实时定量逆转录聚合酶链反应(realtimeRT-PCR)、蛋白免疫印迹(westernblotting)、流式细胞术(flowcytometry)及细胞转染小干扰RNA(siRNA)等实验方法，分别观察:
　　1.体外模拟糖尿病高糖状态，分为低糖组、高渗组和高糖组，分别给予葡萄糖(5.5mmol/L)、葡萄糖+甘露醇(5.5mmol/L+33mmol/L)和葡萄糖(33mmol/L)孵育H9c2细胞，检测cleavedCaspase3和Bcl2蛋白水平的表达，流式细胞术测早晚期凋亡率;
　　2.高糖、高渗和低糖培养心肌细胞，观察ALK7mRNA、蛋白的表达水平，及Smad2/3磷酸化水平的变化;
　　3.设计、化学合成Smad2、Smad3siRNA，采用脂质体转染大鼠H9c2心肌细胞分别抑制Smad2、Smad3的表达，观察高糖对心肌细胞凋亡的影响;
　　4.设计、化学合成ALK7siRNA，构建质粒，采用脂质体转染大鼠H9c2心肌细胞，观察ALK7抑制后，Smad2/3磷酸化水平的变化，以及cleavedCaspase3、Bcl2蛋白水平和细胞凋亡率的变化。
　　结果
　　1.33mmol/L的高糖上调H9c2细胞ALK7的表达。
　　琼脂糖凝胶电泳结果和Westernblotting结果证实ALK7在H9c2细胞系及原代大鼠心肌细胞上均有表达。分别以5.5mmol/L、11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L和38.5mmol/L的葡萄糖孵育H9c2心肌细胞24h，结果显示33mmol/L的糖浓度刺激下，ALK7的表达水平较对照组显著增加（P＜0.05），因此选用33mmol/L的葡萄糖作为高糖刺激浓度;
　　2.33mmol/L的高糖诱导H9c2细胞凋亡。
　　分别以低糖、高渗、高糖孵育H9c2心肌细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h，与低糖组相比，高糖刺激24h，心肌细胞cleavedCaspase3表达增加至1.84倍(P＜0.001)，Bcl2表达降低至51％(P＜0.001)，高糖刺激48h，心肌细胞cleavedCaspase3表达增加至2.41倍(P＜0.001)，Bcl2表达降低至43％(P＜0.001)，高渗组无显著变化。AnnexinⅤ/PI双染流式测凋亡结果显示，高糖刺激24h，心肌细胞出现凋亡增加，以早期凋亡为主，48h出现以晚期为主的凋亡增加;
　　3.Smad2/3参与高糖诱导的H9c2细胞凋亡。
　　低糖、高渗、高糖分别孵育H9c2心肌细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h，高糖刺激12h-48h，Smad2/3的磷酸化水平呈时间依赖性增高，48h达高峰，低糖组和高渗组Smad2/3的磷酸化水平无显著变化。Smad2-siRNA与Smad3-siRNA分别转染H9c2心肌细胞，高糖培养48h，与转染无意义序列组(NS组)相比，cleavedCaspase3的表达分别降低至NS组的58％和52％(P＜0.05，P＜0.05)，Bcl2的表达增高至NS组的2.04倍和2.01倍(P＜0.01，P＜0.001)，流式测细胞凋亡率降低至58％和55％(P＜0.01，P＜0.01)。实验同样探讨了高糖对原代大鼠心肌细胞Smad2/3磷酸化水平的影响，结果显示，25mmol/L的葡萄糖浓度可显著提高原代心肌细胞Smad2/3的磷酸化水平;
　　4.高糖培养不同时间对H9c2细胞及原代大鼠心肌细胞ALK7表达水平的影响。
　　低糖、高渗和高糖培养H9c2细胞0h、0.5h、1h、4h、8h、12h、24h、48h，RT-PCR结果显示，高糖刺激H9c2细胞1h，ALK7mRNA表达水平增加，8h达高峰，增至低糖组的2.98倍（P＜0.01），后逐渐下降，但仍高于低糖组。Westernblot结果显示，高糖刺激H9c2细胞12h，ALK7表达水平开始增加，24h达高峰，增至低糖组的2.06倍(P＜0.001)，48h和24h无显著差异。高渗组ALK7mRNA和蛋白水平无显著变化。实验同样探讨了高糖对原代大鼠心肌细胞ALK7表达水平的影响，结果显示，25mmol/L的葡萄糖浓度可显著上调原代心肌细胞ALK7的表达水平;
　　5.ALK7通过Smad2/3信号转导通路调控高糖诱导的H9c2细胞凋亡。
　　应用ALK7-siRNA转染心肌细胞，与转染阴性对照质粒组(NS组)相比，cleavedCaspase3表达减少至76％(P＜0.01)，Bcl2表达增加至3.42倍(P＜0.05)，心肌细胞凋亡率减少至62％(P＜0.01);应用siRNA抑制ALK7表达后，Smad2/3的磷酸化水平分别降至65％和73％(P＜0.01，P＜0.05)。
　　结论
　　1.33mmol/L葡萄糖可以诱导H9c2细胞凋亡;
　　2.Smad2/3参与高糖诱导的H9c2细胞凋亡的调控;
　　3.高糖可以促进ALK7的表达;
　　4.ALK7通过Smad2/3信号转导通路参与调控高糖诱导的H9c2细胞凋亡。

目录

声明

论文Ⅰ ALK7／Smad信号转导通路在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用

摘要

符号说明

前言

材料方法

结果

讨论

创新点和限制性

结论

附图

参考文献

论文Ⅱ ALK7基因沉默改善2型糖尿病大鼠糖尿病心肌病的研究

摘要

符号说明

前言

材料方法

结果

讨论

创新点和限制性

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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