镍离子对原代小鼠肝细胞毒性作用机理的研究

摘要

随着现代工业的快速发展，镍及其化合物广泛应用于电镀加工、电铸、镍-镉电池等工业领域。镍化合物的生活暴露和职业暴露也对生态环境安全及人体健康构成了巨大的威胁。多年的研究表明，镍类化合物是工业和环境领域的有害物质，它能诱发人类和动物肾脏、肝脏和肺部等的疾病。
　　研究表明氧化应激与所有的疾病有关，环境污染物对生物体产生的危害与氧化应激密切相关。在氧化应激过程中，活性氧类物质(ROS)在生物体内大量表达，参与并促进多种疾病的发生发展过程，造成DNA/RNA、蛋白质、脂类等生物分子的氧化损伤，从而导致机体代谢紊乱，引发疾病。因此，利用氧化应激这一生物学效应指标来评价环境污染物的毒性效应，有助于人们了解环境污染物的致病机理，全面评价其毒性，为疾病的早期诊断、预防和治疗提供科学依据。
　　本文以机体氧化应激理论为基础，以抗氧化系统和氧化应激生物标记物监控指标，从分子水平上探究了Ni2+对氧化应激关键酶空间结构和生理功能的影响，从细胞水平研究了Ni2+暴露下细胞群体和单细胞内氧化应激效应及其作用机理。本文包括以下六个部分:
　　第一章介绍了镍及其化合物的应用领域及其相应的暴露行业，从一般毒性机理、基因毒性、免疫毒性及其分子毒理学研究等方面阐述了不同种镍化合物的多方面致毒机理和此类污染物的研究进展;综述了活性氧物质和抗氧化系统等与疾病的相关关系，总结了环境毒理学中氧化应激的评价方法。
　　第二章以氧化应激关键酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶）为研究对象，利用多种光谱学研究手段，从分子水平上研究了Ni2+对抗氧化物酶结构和功能的影响。研究结果表明:1）Ni2+对抗氧化物酶CAT和SOD的酶活性有一定的抑制作用，对CAT的酶活有明显的时间-剂量效应关系，而对SOD有明显的剂量效应关系;2）Ni2+能猝灭CAT和SOD的内源荧光，剂量效应明显，且一定程度上改变其微环境，CAT和SOD与镍离子以静态猝灭结合;3）综合同步荧光，紫外吸收光谱和CD光谱的结果表明，镍引起了抗氧化酶CAT和SOD的空间构象的变化，从而影响其正常的生理功能。
　　第三章以C57BL/6J系小黑鼠原代肝细胞为研究对象，以CCK-8试验为研究手段，细胞凋亡理论为依据，研究了不同暴露时间和不同暴露剂量Ni2+对原代小鼠肝细胞的活力效应。结果表明:随着暴露时间的延长和暴露剂量的升高，肝细胞活性明显下降。这说明Ni2+暴露剂量和暴露时间一旦超出肝脏的代谢负荷，会导致肝细胞活力降低，最后凋亡。
　　第四章以原代小鼠肝细胞为研究对象，对其进行体外染毒。用荧光探针-荧光成像技术，从细胞群体水平研究了不同浓度的Ni2+对小鼠肝细胞中活性氧含量的变化，从单细胞水平研究了Ni2+不同剂量对小鼠肝细胞内GSH含量的影响。结果表明:低浓度Ni2+暴露时，细胞内ROS变化不明显，高浓度Ni2+暴露下，细胞内ROS大量表达;在低Ni2+染毒浓度时，GSH含量的平均值没有显著的变化，但是单细胞分析的结果显示低GSH含量的细胞开始出现，充分体现单细胞研究技术在疾病早期诊断中的优势;浓度增大时，Ni2+对GSH含量有显著的影响，低GSH含量的细胞增加，高GSH含量的细胞开始减少。
　　第五章以原代小鼠肝细胞为研究对象，对其进行体外染毒。用单细胞凝胶电泳(SCGE)法检测Ni2+对细胞的内DNA的损伤情况。对彗星图像进行分析，结果表明，与对照组相比随着Ni2+浓度的增加，细胞类核从圆润明亮的圆形，变成彗星状，羽毛球状。统计彗星长度，彗星尾长和尾部DNA％等指标，随着Ni2+浓度的增加均呈现出较明显的增长。这说明Ni2+对肝细胞内DNA的损伤直接存在明显的剂量效应关系。
　　第六章以细胞内生物膜脂质过氧化物为生物标记物，利用丙二醛(MDA)实验研究了不同暴露剂量条件下Ni2+对原代小鼠肝细胞膜脂质过氧化的影响，实验结果证实Ni2+对原代小鼠肝细胞中生物膜脂质过氧化物的产生有较为明显的浓度效应关系。MDA实验进一步验证了Ni2+引发原代小鼠肝细胞氧化应激效应的多种生物机制。