甲基苯丙胺对中脑—边缘投射多巴胺神经元电生理学特性的影响及机制研究

摘要

多年的神经解剖学研究表明，多巴胺神经元主要分布于哺乳动物中脑黑质致密部(substantianigra，SN)和腹侧被盖区(ventraltegmentalarea,VTA)，是脑内神经递质多巴胺的主要来源。这些多巴胺神经元在发育过程中，轴突投射至不同的脑区，分别与锥体外系运动、精神与情感以及药物成瘾有关。其中，VTA内向边缘系统投射的多巴胺神经元为中脑-边缘投射神经元，其投射靶区为伏隔核(nucleusaccumbens，NAc)及杏仁体，伏隔核为主要投射靶区。中脑-边缘多巴胺神经元投射是药物成瘾的结构基础，并且是众多中枢神经兴奋剂的作用靶点。近年研究发现，中脑-边缘投射多巴胺神经元具有不同的电生理及分子特性，对不同成瘾药物的反应也不一致。因此，揭示这群多巴胺神经元特异的电生理学特性具有重要的意义。
　　甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)是一种常用的中枢神经兴奋剂，具有严重的成瘾性。近年来研究发现，MA不仅可以抑制神经元兴奋性，还可通过DAT对多巴胺神经元产生兴奋作用。但MA对中脑-边缘投射多巴胺神经元电生理学特性的影响及其机制还不清楚。
　　超极化激活阳离子电流(hyperpolarization-activatedcationcurrent，Ih)是内向去极化电流，可增强神经元的放电频率和兴奋性。Ih电流直接调节神经元膜电位、自发动作电位产生、神经递质释放及突触重塑等生理活动，并与酒精成瘾、帕金森病、抑郁症有关。Ih电流受众多的细胞内物质的影响，如4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶C(PKc)等，也可以受到细胞外众多物质的调控。除中脑内向额叶皮层投射的多巴胺神经元外，大部分中脑多巴胺神经元具有Ih电流，在一定程度上是多巴胺神经元的电生理标志之一。研究发现，多巴胺可作用D2受体激活G蛋白抑制Ih电流。
　　MA主要作用于Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicularmonoaminetransporters2，VMAT2)和多巴胺转运体(dopaminetransporter,DAT)使细胞外多巴胺增加，作用于多巴胺神经元细胞体与树突上的D2受体，使神经元超极化，并作用于DAT产生一定兴奋作用。但是，MA是否影响中脑-边缘多巴胺神经元的Ih电流，以及其潜在的机制还不清楚。
　　为此，我们设计了以下实验来检测MA对中脑-边缘投射多巴胺神经元电生理的影响，及Ih电流的改变和可能的机制。
　　(1)将2周龄Wistar雄性大鼠，固定于立体定位仪上，使用微量注射器将荧光示踪剂注入大鼠NAc区，以标记中脑-边缘投射神经元。然后取脑、固定、切片并进行酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)免疫荧光染色进行鉴定，以确定标记细胞为多巴胺神经元。
　　(2)将逆行示踪大鼠取脑，振动切片，制作含有中脑的组织切片，行脑片膜片钳检测，厚度300μm，孵育后，红外相差显微镜下找到被标记细胞，在全细胞模式下记录不同浓度MA对标记神经元的影响，经前期实验比较分析，确定10μmol/L浓度的MA进行后续实验。在全细胞模式下，观察标记细胞的自发动作电位的基本电生理特点，对标记细胞进行电流注射以观察电流电压反应。
　　(3)施加跃阶测试电压观察产生的Ih电流并以ZD7288、CsCl进行鉴定。用10μmol/LMA作用于标记神经元，观察对Ih电流的影响，并分析Ih电流的电压和时间依赖性变化。
　　(4)为寻找MA抑制Ih电流的可能机制，以D2受体阻断剂舒必利提前孵育脑片后，观察MA对标记神经元自发动作电位频率和膜电位的影响，及MA对Ih电流的影响。
　　结果显示:
　　(1)中脑-边缘多巴胺神经元可被荧光示踪剂准确标记，主要位于中脑的VTA区，免疫组织化学染色呈TH阳性，此结果说明被标记的神经元为中脑-边缘多巴胺神经元。红外相差显微镜下可直接观察到标记神经元。
　　(2)不同浓度的MA对标记神经元具有不同的作用，100μmol/L的MA可明显且迅速的抑制标记细胞的自发动作电位频率，可使标记细胞的自发动作电位停止，但去药后不能完全恢复;1.0、0.1μmol/L的MA对标记细胞的自发动作电位频率无明显的影响;10μmol/L的MA可明显的抑制标记细胞的自发动作电位频率，使其变为对照的（0.63±0.15）％，并且去药后可以恢复。因此我们选定10μmol/L浓度的MA进行实验。发现MA可明显抑制被标记神经元的自发动作电位频率、延长动作电位时程、降低膜电位、增大后超极化电位、减小电压电流反应产生的“sag”(p＜0.05)。“sag”即具有Ih电流的多巴胺神经元在注射超极化电流后膜电位迅速下降，而激活Ih电流后使膜电位上升，逐渐平稳，在超极化电流的注射初期形成一个膜电位的凹陷，称之为“sag”。
　　(3)Ih电流检测分析结果显示，在全细胞模式下，可观察到标记多巴胺神经元具有典型的Ih电流，且可被ZD7288和CsCl所阻断。MA可明显的降低Ih电流幅度(p＜0.05)。MA抑制Ih电流，但并未影响其时间和电压依赖常数。
　　(4)给予D2受体阻断剂舒必利后，发现MA对标记细胞自发动作电位频率和膜电位的抑制作用消失，并使MA产生兴奋多巴胺神经元的作用。同时使MA对Ih电流的抑制消失。
　　综合以上结果表明，10μmol/LMA可抑制中脑-边缘多巴胺神经元的兴奋性和Ih电流，其可能的作用机制是通过激活D2受体导致了对神经元的抑制作用。