内质网蛋白IRE1α在胰岛β细胞中的功能与调控机制的研究

摘要

在真核细胞中，内质网中蛋白质折叠需求的增加会引起内质网应激，诱导未折叠蛋白质应答(unfoldedproteinresponse，UPR)。三个内质网跨膜蛋白，即肌醇必需酶1(IRE1)，PKR样内质网激酶(PERK)以及活化转录因子6(ATF6)，分别介导未折叠蛋白质应答的三条经典信号通路，并协同适应性应答去解决内质网应激，在内质网应激下未折叠蛋白应答对调控细胞存活具有很重要的作用。在非常严重的应激下，UPR无法修复细胞内稳态，细胞将会凋亡。UPR通路与糖脂代谢有密切关系，慢性的内质网应激被认为与很多代谢疾病的发生发展相关。
　　IRE1α是最保守的一个内质网应激感应器，它在胞浆端具有Ser/Thr激酶活性以及内切酶活性。当感应到内质网应激时，IRE1α会通过多聚体化实现相互磷酸化得到激活。在哺乳动物中，IRE1α的RNA酶活性会使得下游转录因子XBP1(Xboxbindgingprotein1)的26个核苷酸切除，这种非常规的剪切会产生一个有活性的XBP1形式，它能驱动很多未折叠蛋白应答相关的基因表达。此外，IRE1α在内质网应激或XBP1缺乏导致IRE1过度激活时可以诱导一批mRNA的降解，IRE1α也被发现在内质网应激时剪切一些microRNA用来调控凋亡。
　　糖尿病是一种慢发多因素造成的复杂性疾病，主要是由于遗传及环境因素共同造成的，其确切的发病机制目前还不清楚。对于人类来说糖尿病是一种非常古老的疾病，大约在3000年前古埃及文献中就有提及。糖尿病是非常常见的疾病，到2010年世界范围内有超过2亿人患糖尿病，预计到2025年在世界范围内大概会超过3亿人，在中国大概有9200万人患有糖尿病，其中有60.7％的人没有被诊断。糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，它可能源于胰岛素分泌缺陷，外周胰岛素敏感性，或由两者共同引起。胰岛素缺乏会引起长期的高血糖进而打乱了体内正常的糖类、脂肪和蛋白质的代谢。糖尿病可以分为不同的类型，主要是1型和2型糖尿病。根据病理学基础，1型糖尿病病人胰岛素分泌很少或不足，必须采取胰岛素来治疗才能存活;2型糖尿病是一种慢性的代谢紊性乱疾病，在世界范围内2型糖尿病的发病率逐渐增加。
　　内质网稳态的打破会引起内质网应激，这会导致胰腺β细胞功能紊乱以及糖尿病的形成，但是IRE1α在胰岛β细胞中的具体功能以及调控机制尚未明确。因此，进一步深入探讨IRE1α在胰岛β细胞中的调控作用、分子机制及其与糖尿病的关联对于临床预防和控制糖尿病意义重大。
　　实验工作分以下三部分开展:
　　第一部分胰岛β细胞IRE1α敲除小鼠的建立以及与1型糖尿病的关系
　　研究目的:构建胰岛β细胞内质网蛋白IRE1α特异性敲除小鼠，初步探索IRE1α在胰岛β细胞中的功能。
　　研究内容:
　　1、利用RIPcre-flox（RIPcre，含有insulin的启动子序列）策略来构建组织（细胞）特异性基因敲除小鼠，即通过双杂合子小鼠Irelf/+∶Cre与Ire1f/+小鼠交配得到β细胞特异性敲除IRE1α小鼠Ire1f/f∶Cre，对照小鼠Ire1f/f以及Cre。通过提取小鼠尾部基因组DNA来鉴定基因型;提取小鼠的胰岛蛋白，来鉴定IRE1α是否被特异性敲除。在小鼠生长的过程中，监控小鼠的体重，小鼠饥饿6小时后的血糖水平、胰岛素水平，以及小鼠的摄食量。
　　2、葡萄糖耐受试验:小鼠10周龄时，基因敲除和对照组小鼠饥饿16小时后，腹腔注射葡萄糖（0.1g/kg体重），用血糖试纸检测注射葡萄糖前和注射葡萄糖后15、30、60、90及120分钟的血糖值，观察基因敲除对小鼠葡萄糖的耐受能力（GTT，glucosetolerancetest）是否有影响。
　　3、胰岛素耐受试验:小鼠11周龄时，基因敲除和对照小鼠饥饿6小时后，腹腔注射胰岛素（0.75U/kg体重），用血糖试纸来检测注射胰岛素前和注射胰岛素后15、30、60、90及120分钟的血糖值，观察基因敲除小鼠对胰岛素的耐受能力(ITT，insulintolerancetest)是否改变。
　　4、取10周龄的小鼠，断颈处死后，提取小鼠的胰岛，将不同基因型小鼠的胰岛放于12孔板中，观察体外胰岛在高糖刺激下的胰岛素分泌(GSIS，glucosestimulatedinsulinsecretion)并检测胰岛内胰岛素含量。
　　5、提取10周龄小鼠的胰岛，并提取胰岛RNA，反转录之后，利用qPCR的方法来检测细胞增殖相关基因的表达。
　　6、10周龄的小鼠，断颈处死后，取胰腺组织并制作胰腺石蜡切片，通过HE染色观察胰岛的形态和大小是否有改变;通过insulin，glucagon和glut2（β细胞葡萄糖转运蛋白2）等抗体的免疫荧光观察胰岛β细胞的比例和β细胞的功能:通过Ki67和insulin共染观察胰岛细胞的增殖。
　　研究结果:
　　1、通过westernblot检测发现，与对照组小鼠相比，基因敲除小鼠胰岛中IRE1α蛋白明显降低，肝脏中IRE1α蛋白没有变化。与对照组小鼠相比，基因敲除小鼠体重、摄食量都没有明显的变化，但是基因敲除小鼠饥饿后血糖要明显的高于对照组小鼠（雌性小鼠和雄性小鼠的表型是一致的），饥饿胰岛素水平下降。
　　2、通过葡萄糖耐受实验(GTT)和胰岛素耐受实验(ITT)发现，基因敲除小鼠的葡萄糖耐受下降，但是对于胰岛素的耐受和对照组相比没有明显的不同。
　　3、体外培养原代小鼠胰岛细胞，然后通过低糖处理和高糖刺激，检测细胞培养基中胰岛素含量，发现基因敲除的小鼠胰岛素分泌明显的低于对照小鼠（Ire1f/f小鼠），胰岛内的胰岛素含量也比对照明显的减少。
　　4、通过HE染色发现，基因敲除小鼠和对照小鼠的胰岛在形态和大小上没有很明显的差异，Ki67免疫荧光结果也显示两组小鼠的胰岛增殖没有明显的不同，β细胞在胰岛中的比例也没有变化，glut2荧光结果也显示β细胞对葡萄糖的响应没有变化。
　　5、通过qPCR结果得出，在IRE1α敲除后，下游基因XBP1的剪切也被抑制，但是与细胞增殖相关的基因表达没有改变。
　　研究结论:
　　1、胰岛β细胞敲除IRE1α后，会引起小鼠血糖升高，血液胰岛素水平下降，对葡萄糖不耐受而外周组织对胰岛素敏感性不变的1型糖尿病症状。
　　2、从HE染色以及免疫荧光结果看，在正常喂食情况下，IRE1α敲除小鼠在胰岛形态大小以及增殖上没有发生改变，但是体外培养的胰岛中胰岛素含量降低，而且高糖刺激的胰岛素分泌也明显减少，证明1型糖尿病的症状可能是因为胰岛素合成以及胰岛素分泌减少引起的。
　　第二部分在高脂饮食刺激下内质网蛋白IRE1α在胰岛β细胞中的作用研究
　　研究目的:通过高脂饲料(60％fat)喂养野生型C57小鼠，探索高脂诱导的肥胖是否能引起胰岛中的内质网应激;用同样的高脂饲料喂养基因敲除小鼠和对照组小鼠，探索IRE1α在胰岛β细胞中的功能与作用。
　　研究内容:
　　1、8周龄野生型C57小鼠分别给予高脂饮食(60％fat)或低脂饮食(10％fat)，每周监控小鼠体重。在给予高脂饮食或低脂饮食第8周，腹腔注射葡萄糖，检测葡萄糖耐受性;第10周时，处死小鼠，提取小鼠胰岛，并提取胰岛中的蛋白及RNA，通过WesternBlot检测内质网应激相关蛋白的变化，qPCR检测内质网应激相关的基因表达以及肥胖引起的增殖相关的基因表达。
　　2、12周龄的基因敲除和对照小鼠，由正常饲料喂食转为高脂饲料(60％fat)喂养，持续12周，每周监测体重以及摄食量的变化，并检测饥饿血糖和胰岛素的含量。
　　3、基因敲除和对照组小鼠经高脂饲养第9周时，腹腔注射胰岛素，检测外周组织对胰岛素的敏感性，在第10周时，腹腔注射葡萄糖，检测小鼠对葡萄糖的耐受能力。
　　4、基因敲除和对照组小鼠经高脂饲养12周后，处死小鼠。每组小鼠中一部分小鼠用来取胰腺组织并制作胰腺石蜡切片，HE染色来观察胰岛的形态、数量和大小;insulin、glucagon和glut2等免疫荧光观察胰岛β细胞的比例和β细胞的功能;Ki67和insulin共染观察胰岛细胞的增殖;TUNEL染色来检测胰岛细胞的凋亡。另一部分小鼠提取胰岛，然后提取胰岛RNA，反转录之后，利用qPCR的方法来检测内质网应激相关基因和细胞增殖相关基因的表达。
　　研究结果:
　　1、高脂饮食的野生型小鼠肥胖的同时，体重增加，伴随着葡萄糖不耐受，与内质网应激相关基因的表达升高，胰岛增殖相关的基因表达上调。
　　2、高脂饮食的IRE1α敲除小鼠与对照组小鼠相比，饥饿血糖进一步的升高，胰岛素含量降低得更加明显，体重与摄食量却没有明显的改变。
　　3、通过HE染色发现，IRE1α敲除小鼠的胰岛在高脂饮食下的大小和数量比对照组要明显降低，而且Ki67染色发现敲除小鼠的胰岛细胞增殖减少，但是β细胞在胰岛中的比例没有明显改变，而且glut2染色也没有明显变化，TUNEL结果显示高脂饮食没有导致胰岛细胞发生明显的凋亡。
　　4、通过qPCR检测发现IRE1α敲除后，XBP1剪切水平下降，增殖相关的基因表达水平也减少。
　　研究结论:
　　1、高脂饮食引起的肥胖可以引起胰岛β细胞中内质网的应激，同时诱导增殖相关基因的表达。
　　2、高脂饮食下，IRE1α敲除小鼠糖尿病症状加重，血糖进一步升高，同时胰岛增殖能力下降，这提示IRE1α在高脂诱导的胰岛增殖中具重要作用。
　　3、从qPCR和Ki67免疫荧光结果更进一步的证明内质网应激感应蛋白IRE1α在高脂诱导的胰岛增殖中起一定的作用非常重要。
　　第三部分IRE1α下游基因XBP1在胰岛β细胞增殖中的调控机制研究
　　研究目的:在大鼠胰岛细胞系INS-1中探索IRE1α下游基因XBP1与细胞增殖的关系，以及寻找XBP1下游靶基因及其调控机制;同时在体外基因敲除小鼠的胰岛细胞中过表达XBP1基因，观察能否找到类似的靶基因的表达。
　　研究内容:
　　1、INS-1细胞分别感染腺病毒Ad-XBP1s及对照腺病毒Ad-EGFP，48小时后，收集细胞，分别提取蛋白和RNA。Western检测XBP1s过表达效率，检测细胞增殖相关基因CyclinD1/D2的表达情况，qPCR检测Ccnd1/d2/a1、Cdk4以及XBP1s下游基因Erdj4的表达。
　　2、将INS-1细胞种于内置盖玻片的12孔板中（为得到爬片），在感染Ad-XBP1s及对照Ad-EGFP病毒两天后，用4％多聚甲醛固定细胞，然后5％的BSA封闭细胞，在Ki67抗体处理后，用荧光二抗，核染料DAPI处理细胞，用激光共聚焦显微镜观察细胞增殖;同样在INS-1细胞感染病毒48小时之后，BrdU处理细胞3小时，4％多聚甲醛固定后，用2N的HCl来处理细胞，之后用BrdU的抗体来做免疫染色，用激光共聚焦来观察细胞增殖的情况。
　　3、准备INS-1细胞，感染腺病毒Ad-shlRE1α，或同时用Ad-XBP1s来感染细胞72小时之后，收集细胞，Trizol裂解细胞提取RNA，qPCR检测Ccnd1/d2，以及XBP1s下游基因Erdj4的表达，同时WesternBlot检测IRE1α沉默效率，以及XBP1s过表达的效率。
　　4、构建CylinD1-luciferase报告基因，通过软件预测CylinD1启动子上可能的XBP1s的结合位点，利用293T细胞共转XBP1s，CyclinD1报告基因以及内控质粒Renilla，通过promega的luciferase检测试剂盒来检测荧光数值。
　　5、从基因敲除小鼠中提取胰岛，然后感染腺病毒Ad-XBP1s或者Ad-EGFP48小时后，提取RNA，qPCR检测XBP1s下游基因表达，同时检测增殖相关基因的表达。
　　研究结果:
　　1、INS-1细胞过表达XBP1s后，Western结果显示XBP1s蛋白明显的过表达，而且CylclinD1表达上升，但是CyclinD2表达没有变化;Q-PCR结果同样显示Ccnd1基因表达上调。
　　2、通过沉默INS-1细胞中IRE1α后，细胞中的CyclinD1蛋白表达下调，同时CyclinD1mRNA水平上同样减少，但是过表达XBP1s之后，CyclinD1蛋白和mRNA水平上均得到恢复。
　　3、Luciferase报告基因结果显示，XBP1s在能够与Ccnd1启动子结合，同时通过点突变的方式得到“ACGT”是XBP1s在Ccnd1启动子上的结合位点。
　　4、Ki67和BrdU免疫荧光实验得出，XBP1s过表达的细胞增殖水平要明显高于对照细胞。
　　5、IRE1α敲除小鼠胰岛通过过表达XBP1s，qPCR结果显示Ccnd1mRNA水平很明显的上调，但是Ccnd2/a1和Cdk4等增殖相关的基因表达没有受到影响。
　　研究结论:
　　1、在大鼠细胞系INS-1中发现，IRE1α下游基因XBP1s可以诱导cyclinD1蛋白和mRNA水平的表达，同时从免疫荧光实验可以得出IRE1α通过下游基因XBP1s调控CyclinD1来促进细胞的增殖。
　　2、XBP1s对CyclinD1蛋白和mRNA水平的上调是通过直接结合其启动子促进其转录完成的。