鼻息肉成纤维细胞在常氧与低氧环境下的原代培养及鉴定

摘要

目的:探讨人鼻息肉的成纤维细胞在常氧与低氧环境下的细胞原代培养及鉴定，以备下一步为研究鼻息肉成纤维细胞的相关实验研究提供比较优良的细胞系，及后续实验研究人鼻息肉的成纤维细胞的生物学特性。
　　方法:取山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉-头颈外科2012年10月～2013年3月的住院患者，经行鼻内镜下鼻息肉切除手术的息肉组织共20例。取出息肉后立即将息肉标本放入4℃的无菌磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，在超净台上培养皿中用PBS溶液反复冲洗、浸泡息肉组织，去除组织内的红细胞及分泌物。将洗好息肉组织剪成1～2mm大小的组织块后，分成2份转移到准备好的EP管中，分别把1ml的0.1％Ⅰ型胶原蛋白酶和1ml的dispaseⅡ酶放入2个EP管中消化过夜。次日取出组织后，放入10ml的离心管中用移液枪轻轻吹打消化后的组织，分离出更多的细胞。分别对2种酶消化后得到的细胞进行计数后，移入60mm培养皿中，加入组织培养液（DMEM+10％胎牛血清+100mg/L链霉素+1×105U/L青霉素）后，分别放在常氧与低氧环境下进行细胞原代培养。（常氧原代培养是以普通空气作为培养箱内的混合气体，控制氧体积分数含量为20％;低氧原代培养则是利用氮气作为培养箱内的混合气体，调控氧体积分数含量至5％。二种原代培养方法的其他培养环境均一致，都是37℃的温度，相对饱和湿度和含体积分数为5％的CO2。）利用倒置相差显微镜，在镜下观察培养细胞的形态、生长繁殖状况、有无污染。最后对人鼻息肉成纤维细胞的形态学进行初步形态学的鉴定后，再用波形蛋白单克隆抗体对培养后的原代细胞行免疫组化染色鉴定。用CCK-8比色法检测成纤维细胞的增殖变化，描绘其生长曲线。
　　结果:dispaseⅡ酶消化组的细胞数目明显高于Ⅰ型胶原酶消化组，两组之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。可以从人鼻息肉组织中分离出成纤维细胞，对其进行原代培养后，在倒置相差显微镜下观察细胞的形态呈梭形、星形、不规则形或多突的纺锤形，胞核较大呈圆形或椭圆形，细胞胞质向外突出，一般有2～3个长短不齐的触角，细胞中央有卵圆形细胞核。在细胞密度高时，细胞之间的排列方式多为平行排列，或呈放射状、漩涡状排列。对本实验中培养的细胞进行波形蛋白单克隆抗体免疫组化染色，免疫组化染色后细胞内出现棕色或棕褐色的标志物者为阳性细胞，证实其为成纤维细胞。在常氧及低氧环境下培养的人鼻息肉成纤维细胞的生长曲线无明显差异。
　　结论:经dispaseⅡ酶消化的组织细胞数目较多，是一种较好获得组织细胞的技术方法。本实验中在常氧及低氧环境下，均可建立比较稳定、可靠的人体鼻腔鼻黏膜成纤维细胞的原代细胞培养模型，这种模型就可以为下一步研究鼻息肉成纤维细胞的相关实验提供比较优良的细胞系，及后续实验研究人鼻息肉的成纤维细胞的生物学特性。