雌激素作用下缝隙连接细胞间通讯对成骨细胞作用的研究

摘要

背景:
　　雌激素在骨改建中发挥重要作用，雌激素缺乏可以引起全身性骨质疏松。雌激素通过诱导成骨细胞增殖和抑制破骨细胞活性促进骨形成和抑制骨吸收，以增加骨量。相邻细胞间缝隙连接蛋白构成的缝隙连接介导的细胞间信号通路，使骨骼细胞在接受胞外刺激后产生的信号分子在相关细胞中迅速传递，使相关细胞群形成一功能整体。前期实验对MC3T3-E1细胞施加10-8mol/L17-β雌二醇作用5d后，应用全基因组基因芯片分析发现缝隙连接信号通路Gja1因子表达明显增强，提示缝隙连接可能在成骨细胞对雌激素反应的信号调控中起重要作用。因此，探讨雌激素作用下缝隙连接细胞间通讯对成骨细胞作用机制，可以为提高骨创伤修复质量及牙槽骨改建塑形以及相关骨疾病的治疗提供理论依据。
　　目的:
　　本实验在前期研究的基础上通过18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinicacid，AGA)抑制缝隙连接信号通路中的关键因子缝隙连接蛋白43，结合MTT、ALP、矿化结节染色、钙离子浓度测定、Runx2蛋白和mRNA测定，探讨雌激素作用下缝隙连接细胞间通讯对成骨细胞作用机制，并针对这个机制和过程采取更有效的应对策略，为提高骨创伤修复质量及牙槽骨改建塑形以及相关骨疾病的治疗开辟新的更广阔的前景。
　　方法:
　　1.体外培养小鼠MC3T3-E1细胞。实验分为四组即:空白对照组;AGA组(30μmol/L);17-β雌二醇(10-8mol/L);17-β雌二醇(10-8mol/L)+AGA组（30μmol/L）。
　　2.应用MTT法和ALP法分别检测四组细胞进行相应处理后的增殖能力及细胞分化活性。
　　3.茜素红染色及钙离子浓度测定四组细胞分化成骨能力。
　　4.运用RT-PCR及免疫印记Westernblot检测四组细胞进行相应处理后的Runx2蛋白及mRNA表达水平。
　　5.采用SPSS17.0对数据进行统计分析。
　　结果:
　　1.MC3T3-E1成骨样细胞生长状况良好。
　　2.细胞增殖情况:17-β雌二醇组与空白对照组相比，细胞增殖活性增加，差异有统计学意义(P＜0.05);加入AGA后，不论是17-β雌二醇组，还是非17-β雌二醇组，细胞增殖活性均明显降低(P＜0.05)。
　　3.细胞碱性磷酸酶表达情况:3天组:与空白对照组相比，17-β雌二醇可增加MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性(P＜0.05)，而5天组，17-β雌二醇增加MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的作用不明显(P＞0.05);加入AGA后，不论是3天组，还是5天组，细胞增殖活性均明显降低(P＜0.05);5天组与3天组相比，随时间延长，各组细胞碱性磷酸酶活性均明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.钙化结节茜素红染色:肉眼及倒置相差显微镜下可见，矿化结节数量:17-β雌二醇组＞空白对照组＞17-β雌二醇+AGA组＞AGA组。
　　钙离子浓度:17-β雌二醇组＞空白对照组，17-β雌二醇+AGA组＞AGA组，有统计学差异(P＜0.05);加入AGA后，不论17-β雌二醇组，还是非17-β雌二醇组，钙离子浓度均明显降低(P＜0.05)。
　　5.实时定量RT-PCR检测成骨分化相关基因Runx2mRNA表达水平:结果显示，加入AGA后，不论是在17-β雌二醇下，还是空白对照组，Runx2mRNA表达水平均明显降低(P＜0.05);17-β雌二醇组与空白对照组相比，Runx2mRNA表达上调约1.2倍，有统计学意义（P＜0.05）;17-β雌二醇+AGA联合刺激组与仅AGA刺激组相比，Runx2mRNA表达增加上调两倍，有统计学意义（P＜0.05）。
　　6.Runx2蛋白表达情况:加入AGA后，不论是否在17-β雌二醇作用下，Runx2蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）;17-β雌二醇组与空白对照组相比，Runx2蛋白表达上调，有统计学意义(P＜0.05);17-β雌二醇+AGA联合刺激组与仅加入AGA刺激组相比，Runx2蛋白表达量上调，有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.适宜浓度及作用时间的17-β雌二醇可以通过Cx43介导的缝隙连接信号通路调节MC3T3-E1成骨样细胞的增殖及分化，促进细胞外基质矿化。
　　2.缝隙连接信号通路是介导适宜雌激素作用下调节成骨细胞活性的有效通路之一，其具体调控机制还有待于进一步研究。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1 实验仪器

2 实验试剂

3 实验细胞

4 主要溶液配制

5 MC3T3-E1细胞培养与传代

6 实验分组及处理

7 细胞增殖(MTT活性测定)

8 ALP活性测定

9 矿化结节及钙离子浓度测定

10 Runx2 mRNA测定

11 Runx2蛋白测定

12 统计学分析

结果

1 MC3T3-E1细胞生长情况

2 细胞增殖活性(MTT)

3 碱性磷酸酶活性

4 矿化结节染色及钙离子浓度测定

5 Runx2 mRNA

6 Runx2蛋白

讨论

全文总结

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表文章