雌激素作用下FGFR1对成骨细胞增殖分化及RSK2表达影响的研究

摘要

背景:骨质疏松症是临床常见的一种骨骼退行性疾病，它的发生是因为骨重建的动态平衡被打破。雌激素能够通过复杂的分子机制影响成骨细胞的功能，促进骨改建。FGF/FGFR信号为成骨过程当中的重要调节因子，对骨骼的发育、形成和修复过程具有重要的生理意义，成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR1)是出生后成骨细胞表达的主要FGFRs。P90核糖体S6蛋白激酶(RSK2)是位于Raf-MEK-ERK级联信号通路下游的一类具有重要作用的效应分子，可以通过多种细胞内蛋白的磷酸化过程调节细胞的分裂、分化和存活等。前期实验中，应用17-β雌二醇（浓度为10-8mol/L）作用于MC3T3-E1细胞株，培养5天后，通过全基因组基因芯片技术，发现FGFR1和RSK2的基因表达明显增强，提示FGFR1和RSK2在成骨细胞对雌激素的反应信号调控中可能起重要作用。因此，进一步研究雌激素作用下FGFR1与RSK2间的相互联系及通讯对成骨细胞的影响和作用机制，可以揭示骨形成和改建的发生机理，同时也为牙槽骨的改建塑形，骨质疏松症及相关骨疾病的治疗提供重要靶点。
　　目的:本实验拟采用特异性FGFR1受体抑制剂PD166866，对体外培养的MC3T3-E1细胞株施加雌激素，结合MTT、ALP、Westernblot和RT-PCR检测，以研究雌激素作用下FGFR1对成骨细胞增殖分化的作用，通过检测通路中RSK2因子的表达，确定雌激素是否通过FGFR1作用于RSK2影响成骨细胞的增殖分化，从而针对这个机制和过程制定有效的应对策略，为相关骨疾病的治疗提供新思路。
　　方法:1.小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞系体外培养。
　　2.实验分为四组，即空白对照组，FGFR1抑制剂（5×10-8mol/L的PD166866）组，雌激素（10-8mol/L的17-β雌二醇）组，雌激素（10-8mol/L的17-β雌二醇）+FGFR1抑制剂（5×10-8mol/L的PD166866）组。
　　3.应用MTT技术和ALP技术分别检测四组细胞的增殖能力和分化活性。
　　4.应用免疫印迹技术(Western blot)分别检测四组细胞的RSK2及其磷酸化水平和OCN的表达水平。
　　5.应用RT-PCR技术对Runx2 mRNA的表达水平进行检测。
　　6.采用SPSS17.0对数据进行统计分析。
　　结果:1.MC3T3-E1细胞生长状况良好。
　　2.细胞增殖情况(MTT):与空白对照组相比，雌激素组细胞增殖活性增加，差异有统计学意义(P＜0.05);加入FGFR1抑制剂后，细胞增殖活性降低（P＜0.05）。
　　3.细胞分化情况（碱性磷酸酶ALP）:与空白对照组相比，雌激素可增加细胞碱性磷酸酶的表达（P＜0.05）;加入FGFR1抑制剂后，雌激素组和非雌激素组的碱性磷酸酶活性均增加（P＜0.05）。
　　4.Westernblot免疫印迹实验检测RSK2、p-RSK2及OCN蛋白表达水平:结果显示四个组的RSK2表达水平没有显著性差异(P＞0.05);17-β雌二醇作用下RSK2的磷酸化水平及OCN的表达明显增加(P＜0.05);FGFR1抑制剂组的RSK2的磷酸化水平及OCN的表达也增加(P＜0.05);17-β雌二醇+FGFR1抑制剂联合刺激组与仅加入FGFR1抑制剂或雌激素组相比，RSK2的磷酸化水平及OCN蛋白表达量上调，有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.成骨分化相关基因Runx2的mRNA表达水平:结果显示，17-β雌二醇作用下，Runx2的mRNA表达上调，有统计学意义（P＜0.05）;加入FGFR1抑制剂后，Runx2 mRNA表达水平也升高（P＜0.05）;17-β雌二醇+FGFR1抑制剂联合刺激组与仅加入FGFR1抑制剂或雌激素组相比，Runx2mRNA表达增加，有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:1.FGFR1参与了雌激素作用下成骨细胞活性的调节。FGFR1信号可以促进成骨细胞的增殖，抑制分化。
　　2.抑制FGFR1可引起RSK2磷酸化水平增高，雌激素通过FGFR1与RSK2调控成骨作用的机制还有待于进一步研究。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1 实验仪器

2 实验试剂

3 实验细胞

4 主要溶液配制

5 MC3T3-E1细胞培养与传代

6 实验分组及相应处理

7 细胞增殖(MTT活性测定)

8 ALP活性测定

9 Western blot检测RSK2，p-RSK2及OCN的蛋白水平

10 RT-PCR检测Runx2 mRNA水平

11 统计学分析

结果

1 MC3T3-E1细胞生长情况

2 细胞增殖情况(MTT)

3 细胞分化情况(碱性磷酸酶ALP)

4 RSK2、p-RSK2及OCN蛋白表达水平

5 Runx2的mRNA表达水平

讨论

全文总结

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表文章