链霉菌Streptomyces sp.LZ35菌株的萜类合酶基因的克隆、异源表达和蛋白质结晶

摘要

萜类化合物(Terpenoids)是化学结构最为丰富的一类天然产物，具有广泛的生理生态作用和药用价值。在萜类化合物的生物合成途径中，萜类合酶（terpene synthase，TPS）是萜类化合物生成步骤中的关键酶，起到环化的作用。不同生物中的TPS具有不同的结构和催化机制，这也就决定了产物萜类化合物的结构多样性和活性多样性。对萜类合酶基因进行克隆、异源表达和晶体结构的研究，有利于发掘新型萜类化合物合成机制，进行代谢调控研究和蛋白结构工程改造。
　　菌株Streptomyces sp.LZ35是产多种抗生素的海洋链霉菌，从厦门集美潮间带土样中分离得到。课题组对该菌株进行了全基因组测序和生物信息学分析，结果表明该菌株中含有4个萜类合酶基因，其中包括1个二萜合酶基因cyclooctatin synthase gene cyc，2个倍半萜合酶基因pentalene synthase gene pen和geosmin synthase gene geo和1个三萜合酶基因hopene synthase gene。
　　本学位论文对其中的二萜合酶基因cyc进行了深入研究。首先，运用分子生物学方法构建了cyclooctatin synthase (CYC) native蛋白和Se-Met CYC蛋白衍生物异源表达体系，确定最优表达条件和纯化方法;其次，获得满足结晶条件的重组蛋白后，进行蛋白质结晶试剂、条件的筛选和优化，得到符合X-射线衍射要求的单晶，分别收集分辨率为1.75(A)（CYC native蛋白）和2.6(A)（Se-Met CYC蛋白）的衍射数据，解析得到二萜合酶的蛋白质结构;第三，进行了CYC蛋白与底物类似物10-F-GGPP的共结晶实验，以期望获得复合物晶体，确定二萜合酶的功能和催化位点，结果未能得到复合物晶体;最后，构建了二萜合酶基因cyc过表达体系，并对改造后的菌株进行二萜类产物的提取、分离和纯化，检测到新型二萜化合物Heng-1。
　　另外本论文还对两个倍半萜合酶基因pen和geo进行了初步研究，采用同样的实验方法构建2个倍半萜合酶基因表达体系，进行蛋白的异源表达和纯化。其中pentalene synthase(PEN)蛋白进行了结晶筛选，没有得到晶体，还需要进行蛋白的优化和再结晶实验;geosmin synthase(GEO)蛋白未能成功表达，需要进一步研究。
　　综上，本学位论文通过分子生物学和蛋白质组学方法，成功解析出二萜合酶CYC蛋白质结构。为确证该蛋白功能，还需继续进行共晶实验、体外蛋白酶活的测定以及过表达效果验证。此外，两个倍半萜合酶仍需进行蛋白的优化和表达条件的摸索。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．萜类化合物生物合成途径

2．克隆策略

2．1．同源序列克隆法

2．2．染色体步移法

2．3．基于生物合成途径的筛选

2．4．基因组挖掘

3．微生物萜类合酶

3．1．真菌

3．2．细菌

4．晶体结构

5．研究展望

第二章 链霉菌Streptomyces sp．LZ35菌株的二萜合酶基因的研究

前言

第一节 二萜合酶cyclooctatin synthase表达体系的构建

1．实验材料

2．方法

3．实验结果

第二节 二萜合酶CYC的蛋白表达和纯化

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果与讨论

第三节 二萜合酶CYC晶体的获得和结构解析

1．实验材料

2．蛋白质结晶实验方法

3．实验结果与讨论

第四节 CYC蛋白与底物共结晶

1．实验材料

2．实验仪器

3．实验方法

4．实验结果与讨论

第五节 二萜合酶基因cyc的过表达

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第六节 二萜类天然产物的提取纯化

1．实验材料

2．发酵用培养基

3．实验方法

4．实验结果

第七节 小结

第三章 链霉菌Streptomyces sp．LZ35菌株的两个倍半萜合酶基因的克隆和异源表达

前言

第一节 倍半萜合酶基因pen的克隆、异源表达和结晶

1．实验材料

2．方法

3．实验结果与讨论

第二节 倍半萜合酶基因geo的克隆和异源表达

1．实验材料

2．方法

3．实验结果与讨论

第三节 小结

第四章 总结与展望

一、本论文研究的意义

二、本论文的主要研究

1．二萜合酶基因cyclooctatin synthase gene cyc的研究

2．两个倍半萜合酶基因的克隆和异源表达

参考文献

研究生期间发表论文

致谢