白藜芦醇对失血性休克所致线粒体损伤和急性胰岛素抵抗的保护作用及潜在机制探讨

摘要

研究背景： 失血性休克是严重创伤性疾病的的致命并发症，亦是某些非创伤出血性疾病（如消化性溃疡出血、食管曲张静脉破裂、妇产科疾病所引起的出血等）的重要死亡原因。急性期大量失血及后期并发的多脏器功能衰竭(multiple organ failure，MOF)是加速失血性休克患者死亡的两大主因。肾脏、肝脏微血管结构复杂，且对氧供依赖程度较高，因此对失血性休克所致的缺血缺氧病理状态尤为敏感。继发性急性肾损伤和急性肝损伤已被证实为重症创伤患者中死亡的独立危险因子，伴发急性肾损伤或肝损伤的患者死亡率明显高于未伴发脏器功能衰竭患者。 研究证实，持续线粒体功能障碍与失血性休克患者MOF的发生和患者的不良预后密切相关。体内多达95％的氧气在线粒体中被利用并进入电子传递链，进而参与合成大量的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，因此，失血性休克的缺血缺氧状态，会直接导致线粒体功能损伤和细胞能量储备耗竭。尽管随后的液体复苏及再灌注过程能够恢复组织氧供，但该过程中线粒体功能障碍依然存在，所产生的大量的活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)会进一步加重线粒体功能损伤。ROS能够直接损伤线粒体蛋白，导致线粒体过滤孔产生、线粒体膜通透性增加、细胞色素c大量丢失，从而加速细胞凋亡。因此，对于失血性休克患者而言，持续的线粒体功能障碍在细胞损伤、脏器衰竭的发生发展过程中扮演了关键角色，采取措施改善线粒体功能、降低线粒体氧化应激水平，是降低细胞损伤、改善脏器功能的重要环节。 急性胰岛素抵抗在创伤和失血性休克患者中较为常见，主要表现为高胰岛素血症和应激性高血糖，二者均已被证实是重症创伤患者预后不佳的独立危险因素。通过对2型糖尿病和肥胖动物模型的研究发现，线粒体功能障碍参与了胰岛素抵抗的发生发展过程。线粒体是参与三大营养物质代谢过程的重要细胞器，线粒体功能障碍会导致脂肪酸β氧化降低，ATP生成减少，ROS产生增加。ROS不仅可以进一步损伤线粒体蛋白及其功能，还激活多种能调节胰岛素信号通路的丝氨酸激酶。已有研究证实，通过阻断线粒体ROS的产生，可以明显缓解创伤后急性胰岛素抵抗和应激性高血糖现象。因此，对于失血性休克患者而言，采取能够有效改善线粒体氧化应激、改善胰岛素抵抗现象的液体复苏策略，可能进一步提二高患者生存率。 白藜芦醇(Resveratrol，RSV)是一种存在于多种植物（葡萄、虎杖、花生、桑葚等）的天然多酚类物质，近年来被证实在多种慢性疾病状态（如糖尿病、阿尔茨海默病、冠心病、肥胖等）中发挥多种有益的生物学作用:如改善线粒体功能、促进线粒体合成、降低氧化应激损伤、改善胰岛素抵抗、调节血糖、抑制炎症反应等。去乙酰化酶1（Sirtuin-1，SIRT1）是白藜芦醇发挥作用的直接配体，与上述白藜芦醇的生物学作用密切有关。SIRT1的酶活性依赖于氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide+，NAD+)和还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的浓度及二者比例，其能够去乙酰化并激活过氧化物酶体增殖受体共激活因子1-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-ycoactivator1-α，PGC1-α)，而后者是调控线粒体合成和抗氧化酶表达的关键因子。PGC1-α不仅可以共激活核呼吸因子1(Nuclear respiratory factors1，NRF1)和NRF2，增加线粒体转录基因的表达，促进线粒体蛋白合成，还可以增加抗氧化酶体系[如超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase2，SOD2)，过氧化氢酶(catalase，CAT)]的表达，增加ROS的清除，并减少ROS对线粒体的损伤。目前，在对创伤和失血性休克患者的研究中，已有白藜芦醇具有保护心脏射血功能、减轻肝脏损伤和肠道损伤的报道，但白藜芦醇对重要脏器线粒体功能和急性胰岛素抵抗的作用尚不明了，相关分子机制也有待进一步深入研究。 本课题将利用失代偿性失血性休克大鼠模型，在液体复苏过程中添加白藜芦醇，综合运用多种线粒体分析技术和分子生物学技术，探讨白藜芦醇对失血性休克所致线粒体损伤、急性胰岛素抵抗现象的保护作用及潜在机制。这些结果将为失血性休克液体复苏提供新的策略，并为白藜芦醇在重症疾病的应用提供理论基础，具有重要的学术理论意义和潜在的临床应用价值。 研究目的： 1.探讨在失血性休克液体复苏时添加白藜芦醇能否改善肝脏、肾脏等重要脏器的线粒体功能功能障碍和线粒体氧化应激损伤，并以肾脏为主探讨所涉及的潜在分子通路及SIRT1-PGC1α途径所发挥的作用; 2.研究白藜芦醇对失血性休克所致的急性胰岛素抵抗现象的保护作用，并探索线粒体功能在该过程中发挥的作用。 研究方法： 1.动物模型:使用雄性Long-Evans大鼠制造急性失血性失代偿休克模型。大鼠麻醉后给予5cm腹部切口模拟皮肤软组织损伤，并接受双侧股动静脉置管，持续监测血压、心率。待大鼠麻醉苏醒后通过动脉置管间断放血至平均动脉压(Mean blood pressure，MAP)降至40mmHg后，通过间断推注乳酸林格氏液（总量为放血量的40％）使其MAP维持在40mmHg（严重休克状态）。推注完毕后给与乳酸林格氏液或乳酸林格氏液+白藜芦醇(30mg/kg)液体复苏，复苏液体量为放血量4倍，微量泵注射维持1小时。分别在出血前（Sham组，n=6）、严重休克时（SS组，n=6）、林格氏液复苏后（LR组，n=6）、林格氏液+白藜芦醇复苏（LR+RSV组，n=6）后四个时间点分别处死大鼠，迅速分离肝脏、肾脏等脏器，差速离心法提取肝脏、肾脏组织线粒体。采集血样送检血气分析、电解质、乳酸和血糖等检测，其余血样离心后分离血浆-80℃冰箱冻存。 2.线粒体复合体呼吸容量测定:使用高分辨呼吸计量仪检测线粒体电子传递链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的呼吸容量。 3.荧光测定法测定:肝脏、肾脏线粒体总ROS产生水平;肾脏组织NAD+、NADH水平及二者比值。 4.分光光度法测定:肾脏线粒体呼吸复合体复合体Ⅳ的电子传递活性;检测肾脏组织完整线粒体定量酶标记-柠檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)活性。 5.蛋白印迹法(Western blot)测定:肾脏线粒体脂质过氧化产物4羟基壬烯酸（4-Hydroxynonenal，4-HNE）和氮族氧化应激产物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）蛋白表达水平;肝脏、肾脏组织磷酸化(pY612)胰岛素受体底物1（Insulin receptor substrate1，IRS-1）的表达水平。 6.肝肾功能测定:干化学法测定血尿素氮(Blood urea nitrogen， BUN)和血清肌酐(Serum creatinine，SCr)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase， ALT)和谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，AST）。 7.实时定量PCR法检测:取大鼠肾脏组织，Trizol法提取RNA，实时荧光定量RT-PCR技术检测PGC1-α、SIRT1及其他涉及氧化应激(SOD2、COX2和Catalase)和线粒体合成调控蛋白的mRNA表达水平(TFAM、NRF1、NRF2等)。 8.血糖测定:除大鼠处死前各时间点外，在液体复苏开始及结束30分钟后，每隔15分钟采集动脉血检测血糖，监测水平。 9.酶联免疫吸附测定法检测:血浆胰岛素和皮质醇水平;血浆炎症介质TNF-α和IL-6水平。 10.放射免疫检定法测定:血浆胰高血糖素和总胰高血糖素样肽-1(GLP-1)水平。 11.计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR指数）=胰岛素(μU/ml)×血糖(mg/dl)/405。 研究结果： （一） 1.生命体征及实验室检查指标:与LR组相比，LR+RSV组大鼠血乳酸水平明显降低（6.9±3.3 mmol/L比10.2±3.0mmol/L，p＜0.05），HCO3-（17.2±3.5mmol/L比11.3±2.8 mmol/L，p＜0.05）和血钠水平（138.0±3.4 mmol/L比130.3±6.1 mmol/L，p＜0.05）明显改善，MAP略升高（86.3±4.9 mmHg比78.0±12.9mmHg），但无统计学意义(p＞0.05)。RSV对动脉血pH、肾脏功能(BUN、SCr)和肝脏功能(ALT、AST)无明显影响。 2.白藜芦醇显著改善肝脏、肾脏线粒体功能:失血性休克导致肝脏线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ呼吸容量明显降低（均p＜0.05），与LR组相比，LR+RSV的各复合体呼吸容量明显恢复（874.9±223.9 pmol/s/mg比589.9±62.8pmol/s/mg;2682.9±421.5 pmol/s/mg比1733.4±128.1 pmol/s/mg;9080.0±1324.7pmol/s/mg比5441.7±483.4pmol/s/mg;均p＜0.05)。 失血性休克导致肾脏各线粒体复合体呼吸容量及活性均明显降低(均p＜0.05)。与LR组相比，LR+RSV组大鼠线粒体复合体Ⅱ、Ⅳ的呼吸容量明显恢复（3137.0±349.5 pmol/s/mg比2000.0±234.9pmol/s/mg;11615.4±1518.9pmol/s/mg比7857.1±695.8 pmol/s/mg;均p＜0.05），复合体Ⅳ的电子传递活性明显升高（1687.3±69.3 nMol/min/mg比1253.8±79.9 nMol/min/mg;p＜0.05)。 3.白藜芦醇明显改善肝脏、肾脏的线粒体氧化应激损伤:与Sham组相比，SS和LR组大鼠肝脏、肾脏的线粒体ROS水平均明显升高（均p＜0.05），而RSV可以显著降低已升高的线粒体ROS水平（均p＜0.05）。在肾脏中，RSV可显著降低脂质过氧化产物4-HNE的表达水平(p＜0.05)，但对氮族氧化应激产物3-NT的表达无影响(p＞0.05)。 4.白藜芦醇明显增加肾脏中SIRT1表达水平和NAD+/NADH比例:严重休克导致肾脏SIRT1的mRNA表达水平明显降低(p＜0.05)，但白藜芦醇可明显恢复其表达水平(p＜0.05)。RSV明显降低NADH浓度，并使NAD+/NADH比例提高近一倍(p＜0.05)。 5.白藜芦醇显著提高肾脏PGC1-α和抗氧化酶系统表达水平，但对线粒体合成因子的表达及线粒体总量无影响(p＞0.05):与LR组相比，LR+RSV组大鼠PGC1-α和抗氧化酶(SOD2和catalase)的mRNA表达水平明显增加(均p＜0.05)，COX2的mRNA表达水平无明显变化(p＞0.05)。RSV对线粒体合成因子（TFAM、NRF1、NRF2）的mRNA表达水平和柠檬酸合成酶活性（即完整线粒体定量酶标记）均无明显影响（均p＞0.05）。 （二） 1.白藜芦醇显著降低失血性休克大鼠的血糖及胰岛素水平，并改善急性胰岛素抵抗:与LR组相比，LR+RSV组大鼠血糖水平明显降低（116.0±20.2 mg/dl比359.0±79.5 mg/dl，p＜0.05），胰岛素水平(1.0±0.4 ng/ml比6.5±3.7 ng/ml，p＜0.05)和Ln HOMA-IR指数（1.30±0.42比4.18±0.68，p＜0.05）均明显下降。LR+RSV组在液体复苏开始后45、60和90分钟的血糖水平均明显低于LR组（均p＜0.05）。 2.白藜芦醇明显升高血浆GLP-1水平，但不影响胰高血糖素和皮质醇水平:失血性休

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摘要

符号说明

第一部分 白藜芦醇对失血性休克所致线粒体损伤的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 白藜芦醇对失血性休克所致急性胰岛素抵抗的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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