乙酰葛根素纳米制剂的脑靶向性及其基于HMGB1--TLR4--NF--κB信号通路的抗炎机制

摘要

研究背景与目的: 脑血管疾病严重危害人类健康，是世界范围内致死、致残的主要疾病之一。脑血管病以缺血性为多见，约占80％，因其发病机制复杂，部位特殊，目前缺乏有效的治疗药物。 葛根素(puerarin，PUE)属于黄酮类化合物，对心脑血管疾病具有明确的疗效，因其口服生物利用度很低（仅有5％-6％），虽然可部分透过血脑屏障，但在脑中浓度极低，故临床应用受到很大限制。乙酰葛根素(acetylpuerarin，AP)为葛根素乙酰化衍生物，我们前期的研究结果证明，乙酰葛根素具有脑保护作用，能够显著减少脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积，改善神经功能缺陷，在缺血性脑病的治疗方面显示出良好的应用前景。但乙酰葛根素在脑组织中的分布如何？体内是通过何种形式起作用的？目前未见文献报道。 纳米粒(nanoparticle，NP)是目前常用的脑部给药制剂。其制备过程简单、药物释放稳定，可避免药物被降解或被P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)泵出细胞，具有缓释效果、药物保护作用、提高药物疗效、降低药物毒性等优点，是脑靶向制剂的良好载体。作为制备纳米粒常用的载体，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)，因其可生物降解为乳酸和羟基乙酸、最终代谢为水和二氧化碳，对人体无毒、无蓄积性，而被FDA批准用于临床研究。 本实验的研究目的之一，即在前期研究的基础上，以PLGA为载体、制备乙酰葛根素纳米给药系统，观察乙酰葛根素的体内过程及其在脑组织中的分布，进一步研究乙酰葛根素PLGA纳米粒的脑靶向性及其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。 炎症反应是缺血性脑损伤的重要机制之一，缺血和再灌注早期产生的细胞因子（如IL-1β、TNF-α等）和黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1等）构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础。因此，及时有效的抗炎治疗有助于缓解脑缺血再灌注造成的损伤程度。 高迁移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)是一类广泛存在于真核细胞胞核内、高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白。近年来大量研究证实，HMGB1可作为致炎细胞因子参与炎症反应。炎症状态下HMGB1可由坏死细胞被动释放或由受刺激的单核/巨噬细胞等主动分泌至胞外，与高级糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)和Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)结合，最终激活NF-κB，介导炎症反应。 HMGB1及其受体在中枢神经系统广泛表达，在炎症、凋亡及血-脑屏障通透性调节中起着重要作用。在脑缺血损伤时，由于脑血管闭塞，脑血流量迅速下降，导致缺血核心区出现急性坏死，而周围组织（即缺血半暗带）也经历了炎症、自由基、兴奋性氨基酸毒性、细胞内Ca2+超载、能量代谢障碍、细胞凋亡等病理生理学过程，促使神经细胞、神经胶质细胞及脑血管内皮细胞释放HMGB1，而HMGB1又能加剧谷氨酸和糖氧剥夺的神经损害作用，促使iNOs、COX-2、IL-1β和TNF-α等炎症介质释放，促进神经细胞死亡。可见，HMGB1是联系脑缺血后早期兴奋性毒性损伤和随后炎症损伤的中介。 前文提到，HMGB1与RAGE或TLRs结合后可激活NF-κB、介导炎症反应。我们前期研究结果表明，乙酰葛根素具有抗炎作用，能降低或下调脑缺血再灌注损伤引起TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1等细胞因子及黏附分子的升高，也可降低脂多糖刺激所致星形胶质细胞NF-κB(p65)在胞核内表达的升高，从而发挥其抗炎作用。那么，乙酰葛根素对HMGB1-TLR4-NF-KB信号通路的上游因子HMGB1有何作用？其对该信号通路的调控机制如何？未见文献报道。 本实验的另一个研究目的，即是在前期研究的基础上，深入探讨乙酰葛根素对HMGB1蛋白表达及释放的影响及其基于HMGB1-TLR4-NF-KB信号通路的抗炎机制。 实验方法: 一、乙酰葛根素-PLGA纳米粒的制备及质量评价 （一）以PLGA为载体材料，采用溶剂扩散法制备吐温-80包衣的乙酰葛根素-PLGA纳米粒(AP-PLGA-NPs)。 （二）在单因素考察的基础上，以PLGA浓度、相体积比及AP投药量为主要考察因素、以AP在纳米粒中的包封率、载药量为评价指标，采用均匀设计-效应面结合法优化处方与制备工艺。 （三）对优化条件下制备的AP-PLGA-NPs通过形态观察、粒径及Zeta电位测定、体外释药实验、初步稳定性考察等对纳米粒进行质量评价。 二、乙酰葛根素-PLGA纳米粒大鼠体内的药代动力学研究 （一）通过对样品处理方法、色谱条件、质谱条件、方法专属性、标准曲线、精密度、回收率、基质效应等进行考察，建立AP及其代谢物PUE血浆浓度测定的液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)分析方法，并进行方法确证。 （二）采用LC-MS/MS法测定AP静脉及口服给药后AP及代谢物PUE在大鼠体内的血浆浓度。 （三）采用DAS2.1.1软件计算AP及PUE药代动力学参数，考察AP的体内过程，评价纳米粒对AP及PUE药代动力学参数的影响。 三、乙酰葛根素-PLGA纳米粒在小鼠体内的组织分布及脑靶向性评价 （一）通过对样品处理方法、色谱条件、方法专属性、标准曲线、精密度、回收率等进行考察，建立AP及其代谢物PUE组织浓度测定的高效液相色谱(HPLC)分析方法，并进行方法确证。 （二）采用HPLC法测定AP静脉给药后PUE在小鼠不同组织的经时药物浓度、AP及PUE在脑组织的经时药物浓度，考察其组织分布。 （三）以总靶向系数（overall targeting efficicency, Te）、相对摄取率(relativetargeting efficicency, Re)和峰浓度比(Ce)为靶向评价指标，评价AP-PLGA-NPs的脑靶向性。 四、乙酰葛根素-PLGA纳米粒对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 （一）参照Zea Longa大脑中动脉内栓线法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。 （二）实验分为假手术（sham）组、脑缺血再灌注模型(I/R)组、AP溶液低剂量组(AP-L)、AP溶液高剂量组(AP-H)、AP-PLGA纳米粒(AP-NPs)组及对照药丙酮酸乙酯(EP)组。采用Zea Longa评分法进行神经功能缺陷评分、TTC染色法测定大鼠脑梗死体积、HE染色法观察大鼠缺血皮层及海马组织病理形态学变化、TUNEL染色法观察缺血皮层神经细胞凋亡率。以上述指标为主要评价指标，考察AP-PLGA-NPs对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。 五、乙酰葛根素对HMGB1蛋白表达的影响及其基于HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路的抗炎机制 （一）建立BV-2细胞缺糖缺氧损伤模型，分为正常对照组、OGD模型组、不同剂量(0.1、0.4、1.6μM)乙酰葛根素处理组、丙酮酸乙酯(1mM)处理组。 采用CCK-8试剂盒检测OGD6h、12h、24h、48h各组BV-2细胞活性，考察乙酰葛根素对OGD损伤细胞活性的影响;采用细胞核Hoechst33258染色法、FITC-AnnexinⅤ/7-AAD双染法检测BV-2细胞凋亡情况，考察乙酰葛根素对OGD损伤细胞凋亡的影响;采用免疫荧光法观察乙酰葛根素对细胞内HMGB1释放的影响。 （二）观察大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间点HMGB1的动态表达 Western blot法检测I/R后不同时间点HMGB1的表达;酶联免疫分析(ELISA)法测定I/R后不同时间点大鼠血清中HMGB1浓度。 （三）考察AP对HMGB1、TLR4、NF-κB(P65)蛋白表达的影响 实验分为假手术（sham）组、脑缺血再灌注模型(I/R)组、乙酰葛根素低剂量组(AP-L，15mg/kg)、乙酰葛根素高剂量组（AP-H，30mg/kg）、丙酮酸乙酯组(EP，40mg/kg)。 采用Western blot法检测I/R24h HMGB1、TLR4、NF-κB(P65)的蛋白表达;免疫组化法分析HMGB1、NF-κB(P65)阳性细胞表达及在胞核或胞浆的转位;ELISA法测定大鼠血清中HMGB1浓度，进一步考察AP的干预效果，探讨其基于HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路的抗炎机制。 实验结果: 一、乙酰葛根素-PLGA纳米粒的制备及质量评价 （一）根据均匀设计-效应面优化法确定的最佳处方 PLGA在丙酮中的浓度=18mg/mL，相体积比=4，投药量=7mg。 （二）依据优化处方制备的PLGA纳米粒外观为蓝色带乳光胶体溶液，电镜下观察纳米粒子呈圆形，无粘连，平均粒径145.0nm，Zeta电位-14.81mV，多分散系数PI为0.153，EE为90.51％，DL为17.07％。 （三）AP纳米粒体外释药符合双相动力学过程，分为突释相和缓释相。经经典释放模型拟合，AP原料药体外释放符合一级动力学方程，纳米粒体外释放符合Higuchi方程。AP-PLGA-NPs具有明显的缓释效果。 （四）稳定性考察表明AP纳米胶体溶液4℃保存较为稳定。 二、乙酰葛根素-PLGA纳米粒大鼠体内的药代动力学研究 （一）AP静脉给药后，大鼠血浆中可同时测得AP及其代谢物PUE;而AP口服给药后，血浆中仅测得代谢物PUE。 （二）与AP溶液相比，AP-PLGA-NPs的药代动力学参数显著改变，AP及代谢物PUE的AUC0-∞为5398.60±724.77、15106.98±3652.73 ng·mL-1·h，分别为AP溶液的2.90及2.29倍;AP及PUE的t1/2为3.22±0.52h、3.58±0.41h，分别为AP溶液的2.19及1.98倍;但AP及PUE的Cmax与AP溶液相比无显著性差异。 （三）大鼠口服AP-PLGA-NPs后，PUE的AUC0-∞、Cmax为6175.66±350.31ng·mL-1·h、1301.13±101.41 ng·m mL-1，分别为与AP混悬液的2.75及1.78倍，表明PLGA纳米粒可促进AP的吸收、提高生物利用度。 三、乙酰葛根素-PLGA纳米粒在小鼠体内的组织分布及脑靶向性评价 （一）小鼠静脉注射AP溶液后，PUE在肝脏分布最多、其次为肾脏，然后依次为心、肺、脾、脑;静脉注射AP-PLGA-NPs后，PUE的组织分布显著改变，各组织中AUC值均有所增加，以脑及肝脏组织增加最为显著;PUE在各组织的滞留时间明显延长，以脑组织最为显著。 （二）小鼠静脉注射AP制剂后，脑组织中可同时测得AP及其代谢物PUE。 （三）与AP溶液相比，AP-PLGA-NPs静脉给药后，AP及PUE在脑组织的分布显著升高，表现为PUE的Te值由1.28％增至2.29％，AP及PUE的Re值分别为2.40、2.58，Ce值分别为1.91、1.89，表明纳米粒能显著增加药物脑内分布。 四、乙酰葛根素-PLGA纳米粒对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 （一）I/R模型组大鼠神经功能缺陷评分(NDS)多为3分。AP静脉给药可显著降低大鼠NDS(p＜0.01)。与同剂量AP溶液（AP-L，2.17±0.39）相比，纳米制剂组（AP-NPs，1.42±0.51）降低大鼠NDS的效果更为显著(p＜0.01)。 (二)TTC染色结果显示I/R模型组大鼠缺血侧脑梗死体积达40.14±2.61％。AP静脉给药可显著降低脑梗死体积（P＜0.01）;与同剂量AP溶液(AP-L，29.39±3.67％)相比，

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 缺血性脑病的危害及药物治疗现状

2 脑靶向纳米给药系统研究进展

2．1 血脑屏障及药物透过血脑屏障的机制

2．2 纳米粒作为脑靶向给药系统的研究进展

2．3 制备纳米粒常用的载体

3 葛根素制剂在缺血性脑病中的应用及展望

3．1 葛根素在缺血性脑病中的应用及不足

3．2 乙酰葛根素用于缺血性脑病的药理学基础及展望

4 HMGB1在脑缺血再灌注损伤中的作用

4．1 炎症反应与脑缺血再灌注损伤

4．2 HMGB1的释放及信号转导

4．3 HMGB1与炎症反应

4．4 HMGB1与脑缺血再灌注损伤

5 本研究的目的及研究内容

第一部分 乙酰葛根素-PLGA纳米粒的制备及质量评价

1 材料

1．1 药物与试剂

1．2 仪器与设备

2 实验方法

2．1 AP体外分析方法的建立及确证

2．2 AP-PLGA纳米粒的制备方法

2．3 包封率和载药量的测定

2．4 处方及工艺的单因素考察

2．5 均匀设计-效应面结合法优化处方工艺

2．6 AP-PLGA纳米粒的质量评价

3 实验结果

3．1 形态

3．2 粒径分布及Zeta电位

3．3 纳米粒体外释放结果

3．4 纳米粒的初步稳定性

4 讨论

4．1 纳米粒制备方法的选择

4．2 表面活性剂吐温-80的选择

4．3 实验优化方法的选择

4．4 纳米粒的粒径及Zeta电位

4．5 体外释放动力学

4．6 初步稳定性考察

5 小结

附录

第二部分 乙酰葛根素-PLGA纳米粒大鼠体内药代动力学研究

1 材料

1．1 药物与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 实验动物

2 实验方法

2．1 LC-MS／MS分析方法的建立及确证

2．2 大鼠静脉给药的药代动力学

2．3 大鼠口服给药的药代动力学

2．4 统计分析

3 实验结果

3．1 AP静脉给药的药代动力学

3．2 AP口服给药的药代动力学

4 讨论

5 小结

附录

第三部分 乙酰葛根素-PLGA纳米粒小鼠体内的组织分布及脑靶向性评价

1 材料

1．1 药物与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 实验动物

2 实验方法

2．1 PUE分析方法的建立及确证

2．2 AP分析方法的建立及确证

2．3 小鼠体内组织分布

2．4 脑靶向评价

2．5 统计分析

3 实验结果

3．1 PUE在小鼠各组织的分布

3．2 AP在小鼠脑组织的分布

3．3 脑靶向性评价

4 讨论

5 小结

附录

第四部分 乙酰葛根素-PLGA纳米粒对大鼠脑缺血／再灌注损伤的保护作用

1 材料

1．1 药物与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 实验动物

2 实验方法

2．1 实验设计

2．2 大鼠局灶性脑缺血／再灌注模型的制备

2．3 神经功能缺陷评分(NDS)

2．4 脑梗死体积测定

2．5 组织病理学检查

2．6 TUNEL法检测大鼠缺血侧脑皮质细胞凋亡

2．7 统计学处理

3 实验结果

3．1 神经功能缺陷评分

3．2 脑梗死体积

3．3 组织病理学

3．4 大鼠缺血侧脑皮质区TUNEL染色结果

4 讨论

5 小结

附录

第五部分 乙酰葛根素对HMGB1蛋白表达的影响及其基于HMGB1-TRL4-NF-KB信号通路的抗炎机制

1 材料

1．1 药物与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 细胞及动物

1．4 Western blot用试剂配制

2 实验方法

2．1 实验设计

2．2 CCK-8法检测BV-2细胞活性

2．3 细胞核Hoechst33258染色实验

2．4 FITC-Annexin V／7-AAD双染法检测细胞凋亡实验

2．5 Western Blot分析

2．6 免疫组化分析

2．7 酶联免疫分析

2．8 统计分析

3 实验结果

3．1 OGD不同时间点BV-2细胞活性及AP的影响

3．2 AP对OGD诱导的BV-2细胞凋亡的抑制作用

3．3 AP对OGD诱导的BV-2细胞HMGB1核释放的影响

3．4 大鼠脑缺血再灌注后不同时间点HMGB1的动态表达

3．5 AP对大鼠缺血侧大脑皮层组织HMGB1蛋白表达的影响

3．6 AP对大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4蛋白表达的影响

3．7 AP对大鼠缺血侧大脑皮层组织NF-κB(p65)蛋白表达的影响

4 讨论

5 小结

附录

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间学术情况目录

附录：已发表或待发表英文论文