Sam68调控NF1外显子23a可变剪接的初步研究

摘要

Pre-mRNA剪接是指剪接体正确识别、连接短外显子并精确去除长内含子，从而转录成熟mRNA的过程。可变剪接是指从一个mRNA前体通常可以通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体。可变剪接是生物功能复杂性和蛋白质组多样性的重要原因，其错误调控会引起细胞组织特异性分化、发育的异常乃至疾病的发生。I型神经纤维瘤病（NF1）是一种常见的常染色体显性遗传病，该疾病的发病率为1/3500。NF1基因可变剪接通常发生在外显子9a/9br，10a-2，23a和48a区域。外显子23a位于神经纤维瘤素蛋白GRD酶活性功能域中，可调控Ras活性。Sam68（SRC associated in mitosis of68 kD）是集信号转导特性与RNA激活功能于一身的RNA结合蛋白，参与转录、信号转导、细胞周期调控、可变剪接及核输出等过程。已证明Sam68通过识别靶基因外显子/内含子邻近富含AU的序列而参与调控可变剪接。而NF1基因可变外显子23a侧翼序列富含AU序列如（UAAA或UUUA）。到目前为止，还未有关于Sam68调控NF1的相关报道。本论文在构建了NF1及突变体微基因及Sam68重组质粒的基础上，将NF1微基因及突变体微基因及过表达Sam68重组质粒共转染HeLa细胞，并通过Cy3荧光标记半定量RT-PCR体系检测Sam68是否调控NF1外显子23a的可变剪接。此研究对后续研究Sam68调控NF1可变剪接的分子机制及进一步为I型神经纤维瘤病疾病的发生、发展及治疗具有一定的指导意义。具体内容如下：
　　1、Sam68重组质粒的构建及表达：从293T细胞提取总RNA，反转录cDNA，通过特异性引物扩增Sam68目的片段，进而构建出Sam68重组质粒，并将Sam68重组质粒转染到HeLa细胞内，用G418进行稳定细胞株的筛选。为后续研究Sam68剪接因子是否调控NF1基因及Sam68剪接因子调控NF1基因机制奠定基础。
　　2、建立Cy3荧光标记半定量RT-PCR体系：以Cy3荧光标记NF1可变外显子23的上游引物，利用半定量RT-PCR技术确定NF1外显子23a的保留率。并在此基础上探讨了RT-PCR扩增循环数和起始模板量对Cy3荧光标记半定量RT-PCR分析结果的影响，进而确定其最佳的扩增条件。
　　3、构建NF1微基因及突变体微基因：从人类外周血中提取人类全基因组DNA，利用PCR方法扩增目的片段并导入pEGFP质粒载体中，从而构建了分别包含NF1微基因及突变体微基因。用酶切及菌落 PCR将构建的NF1微基因及NF1突变体微基因进行鉴定，将鉴定正确的NF1微基因及NF1突变体微基因分别命名为pEGFP-NF1和pEGFP-NF1m，为后续pEGFP-NF1及pEGFP-NF1m表达奠定基础。

目录

声明

1 引 言

1.1 可变剪接

1.2 Sam68的概述

1.3 NF1基因的概述

1.4 本文主要内容及意义

2 Sam68重组质粒的构建及表达

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5 小结

3 Cy3荧光标记半定量PCR体系的建立

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3结果与分析

3.4 讨论

3.5小结

4 NF1微基因及突变体微基因的克隆与鉴定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

4.5小结

结论

参考文献

附录A 实验仪器

在校研究成果

致谢