TLR4对脂多糖诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌Il-1β、TNF-α的影响

摘要

本文主要从以下两个部分展开论述：
　　第一部分 大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞的分离培养
　　目的:分离大鼠颞下颌关节滑膜组织，培养滑膜成纤维细胞，并建立稳定的滑膜成纤维细胞体外培养体系。
　　方法:取大鼠颞下颌关节双板区的滑膜组织，采用酶消化法分离培养原代滑膜细胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，并采用免疫荧光细胞化学方法检测波形蛋白(vimenin)和CD68的表达。
　　结果:倒置显微镜下可见细胞呈梭形，细胞外形均匀一致，具有成纤维细胞的形态，所有培养的滑膜细胞均对CD68蛋白表达阴性，波形蛋白表达阳性。
　　结论:采用酶消化法可成功分离培养大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞，为后续实验研究奠定了基础。
　　第二部分 TLR4对脂多糖诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响
　　目的:研究Toll样受体-4(Toll like receptors4，TLR4)对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响，探讨TLR4在颞下颌关节紊乱病发病机制中的作用。
　　方法:以终浓度为0，0.1，1，10，100 ng/mL的LPS刺激滑膜成纤维细胞12h，或以LPS（终浓度100ng/mL）刺激细胞0，1，6，12，24h，检测LPS刺激与IL-1β、TNF-α表达的量效和时效性关系，选择最佳的刺激浓度与时间。应用LPS刺激细胞，Western blot方法检测细胞内TLR4、MyD88的表达变化，采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况，应用Real-time PCR检测细胞内TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表达变化。用TLR4的特异性抑制剂TAK-242预处理滑膜成纤维细胞后，再加入LPS刺激细胞，应用Real-time PCR检测IL-1β、 TNF-αmRNA的表达变化，采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况。
　　结果:经LPS刺激后，随着LPS刺激浓度的增加IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表达量逐渐升高。并且，二者与LPS刺激持续时间呈现一定的时间依赖关系，IL-1β、TNF-α蛋白表达量在12h到达高峰，IL-1β、TNF-αmRNA在6h到达高峰。LPS能够明显增强TLR4、MyD88 mRNA及蛋白表达，TAK-242的应用能显著抑制LPS诱导的滑膜成纤维细胞IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达。
　　结论:TLR4在LPS诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α过程中起到重要的调控作用，特异性抑制剂TAK-242可以有效地抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达。TLR4可能参与了颞下颌关节紊乱病的发生发展过程。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞的分离培养

1 材料与方法

1．1 实验动物来源

1．2 主要仪器和试剂

1．3 实验方法

2 实验结果

2．1 滑膜细胞的形态学观察

2．2 免疫荧光细胞化学鉴定滑膜成纤维细胞

2．3 采用MTT法检测滑膜成纤维细胞的增殖情况

3 讨论

4 结论

第二部分 TLR4对脂多糖诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响

1 材料与方法

1．1 细胞来源

1．2 主要仪器和试剂

1．3 实验方法

2 实验结果

2．1 LPS对SFs表达IL-1β、TNF-α的影响

2．2 LPS对SFs表达TLR4、MyD88的影响

2．3 TLR4对LPS诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

致谢

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