β-arrestin2通过调控多药耐药基因1(MDR1)的表达影响乳腺癌多药耐药的相关性研究

摘要

目的：乳腺癌严重威胁着女性的身体健康，化疗是其非常有效的治疗手段。然而，在乳腺癌临床化疗过程中，逐渐出现的多药耐药严重阻碍了化疗的成功。多药耐药，即肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时，对其他结构、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生抗药性。多药耐药的机制非常复杂，人类多药耐药基因1(MDR1)编码的p-糖蛋白(MDR1/p-gp)的过表达是其最主要的机制之一。P-gp是一种镶嵌于细胞膜上的泵蛋白，该蛋白过度表达可以导致化疗药物从肿瘤细胞中外排增强，降低了细胞内有效药物浓度，从而使肿瘤细胞对于化疗药物表现出抵抗性。现如今，尽管已开发了多种针对MDR1/P-gp的抑制剂及调节剂，但其毒性及副作用限制了其临床应用，并未取得非常满意的治疗效果。近年来，基于调控P-糖蛋白转录的信号通路的分子靶向治疗，或许可以为逆转肿瘤的多药耐药带来新的希望。β-抑制蛋白，包括β-arrestin1和β-arrestin2，是一种广泛分布在各种组织和细胞的多功能蛋白，其经典的功能是介导G蛋白耦联受体(GPCR)的脱敏和内吞。此外，β-arrestin还可以结合其他信号分子，调节这些分子的磷酸化、泛素化或者细胞内定位等，从而调控相应的信号通路。最近很多的研究表明β-arrestin2在很多病理过程中发挥重要作用，尤其是广泛参与很多恶性肿瘤的演进过程。MistreAlemayehu等研究发现β-arrestin2直接调节乳腺癌MDA-MB-231细胞中LPA诱导的侵袭和迁移过程。Buchanan等也发现β-arrestin2可以调节大鼠结肠癌的转移过程。此外，在乳腺癌中，β-arrestin2也可以通过caspase-8通路发挥抗凋亡作用。我们最近的研究发现，β-arrestin2还可能参与调节乳腺癌中MDR1/p-gp介导的多药耐药。我们发现在乳腺癌临床标本中β-arrestin2与MDR1/p-gp的表达密切相关。同时，我们检测了β-arrestin2在乳腺癌敏感细胞系ADM以及耐药细胞系MCF-7和MDA-MB-231中的表达，发现其在耐药细胞中的蛋白和mRNA水平均高于敏感细胞。因此我们推测β-arrestin2可能参与乳腺癌的多药耐药过程，从而干扰β-arrestin2可以逆转乳腺癌化疗过程中出现的多药耐药。
　　方法：⑴分别用Q-PCR及Western blot的方法检测3种乳腺癌细胞系ADM，MCF-7以及MDA-MB-231中β-arrestin2与MDR1/p-g的表达情况。⑵乳腺癌敏感细胞MCF-7及MDA-MB-231分别给予浓度为0，1μmol/L，2.5μmol/L，和5μmol/L的阿霉素作用72h后提取细胞总蛋白进行western blot检测β-arrestin2及MDR1蛋白水平表达的改变。⑶收集临床乳腺癌标本进行β-arrestin2与MDR1/p-gp的免疫组化染色，并分析两者之间的关联性。⑷设计并合成针对β-arrestin2基因的双链干扰RNA序列以及非靶向性干扰序列作为阴性对照，将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中，构建稳定表达载体pSUPER-siβ-arrestin2和pSUPER-siNC; pCDNA3.1-β-arrestin2-GFP全长表达载体由美国东田纳西大学尹德领教授惠赠。⑸上述质粒载体分别转染3种乳腺癌细胞，继续培养48-72小时后，分别用Q-PCR和Western blot检测各组细胞中β-arrestin2与MDR1/p-gp在mRNA和蛋白水平的表达情况。应用MTS法检测各组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂的半数细胞致死量的改变。
　　结果：①对3种乳腺癌细胞系检测发现β-arrestin2在耐药细胞ADM中无论mRNA水平还是蛋白水平均较2种敏感细胞明显升高，而MDR1/P-gp仅在ADM细胞中高表达，敏感株中几乎不表达。②MCF-7及MDA-MB-231细胞经阿霉素诱导后通过western blot检测发现，β-arrestin2及MDR1的蛋白水平呈浓度依赖性升高。③对临床收集的106例乳腺癌样本，用免疫组织化学染色检测β-arrestin2和MDR1/P-gp的表达，经过分析二者Pearson相关系数为0.227，呈低度相关性且有显著意义P=0.016。④转染48h后，应用Q-PCR检测各组细胞中β-arrestin2和MDR1 mRNA水平的表达情况，结果显示:与对照组相比，β-arrestin2干扰组的β-arrestin2及MDR1mRNA水平均明显降低。Western blot检测结果表明β-arrestin2干扰组细胞2种蛋白的表达水平也明显降低。⑤MTS法检测各组乳腺癌细胞对4种化疗药物的耐受性，发现β-arrestin2干扰组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂的半数细胞致死量（IC50值）明显降低，耐药性被不同程度逆转。
　　结论：β-arrestin2与MDR1在乳腺癌细胞及组织中的表达具有一定的相关性，提示β-arrestin2可能通过调控MDR1的表达间接影响乳腺癌的多药耐药。干扰或过表达β-arrestin2可以抑制或促进MDR1的表达，从而影响细胞对化疗药物的耐受性。提示β-arrestin2有可能成为逆转多药耐药的靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 β-arrestin2和MDR1基因在人体乳腺癌细胞系及人体乳腺癌组织中的表达情况

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 乳腺癌耐药细胞株转染质粒pSUPER-siβ-arrestin2通过抑制MDR1的表达来逆转多药耐药

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

结论

本研究的创新点及局限性

致谢

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