乙醛脱氢酶2对高脂诱导的血管内皮功能障碍的影响及其机制研究

摘要

论文Ⅰ
　　乙醛脱氢酶2对高脂诱导的血管内皮功能障碍的影响及其机制研究
　　背景：
　　目前心血管疾病如冠心病、高血压和糖尿病心血管并发症发病率逐年上升，已经成为危害中国和世界人民健康的“头号杀手”，如何提高心血管疾病的预防和诊治水平已经成为目前迫切需要解决的重大医学和社会问题。这些疾病的共同病理学基础都是血管病变，即血管功能障碍和结构异常。然而目前对于血管内皮功能和结构的调控、病变发生的分子机制以及干预靶点还不十分清楚。
　　血管内皮功能障碍主要表现为内皮依赖性血管舒张功能降低、炎症反应以及血管通透性增加等;胰岛素抵抗是指机体的效应器官或组织对胰岛素作用不敏感的一种病理生理现象，与冠心病、糖尿病和肥胖等许多代谢和心血管疾病的发生和发展密切相关，这些疾病在发生的早期均有不同程度的血管内皮功能障碍和胰岛素抵抗。通常胰岛素抵抗和血管内皮功能障碍共同存在、相互促进。胰岛素抵抗的患者一般会同时存在有胰岛素诱导的血管舒张功能减弱。研究表明，在高糖、高脂、炎症因子、氧化应激等心血管致病因素刺激下，胰岛素信号传导通路受损，引起胰岛素抵抗，胰岛素通过IRS-PI3K-Akt信号通路刺激血管内皮产生NO减少，导致血管内皮功能障碍。
　　NLRP3炎症小体是目前研究最多的一种炎症小体。NLRP3属于NOD样受体(NLR)家族蛋白，它可以被高糖、高脂、炎症因子、氧化应激等致病因素以及其他各种类型的分子、细菌和病毒所激活，然后与Caspase和ASC共同形成高分子量的蛋白复合体，即为“炎症小体”，从而活化Caspase-1，促进IL-1β前体分子的成熟和释放，引起炎症反应。目前对于NLRP3炎症小体的激活和调控机制还不是很清楚。研究认为，活性氧物质(ROS)可以激活NLRP3炎症小体，ROS能够使TXNIP与TRX解离，从而使TXNIP与NLRP3结合，进而激活NLRP3炎症小体。最近，Zhou等人发现来源于线粒体的ROS对于NLRP3炎症小体的激活具有非常关键的作用。NLRP3炎症小体与许多疾病密切相关，最新研究表明它在动脉粥样硬化和糖尿病的发生和发展过程中具有重要作用，是二者共同的危险因素。
　　乙醛脱氢酶(ALDH2)是人体内乙醇代谢的关键酶，主要存在于线粒体。除催化乙醇代谢产物乙醛氧化为乙酸外，它还可以将其他毒性醛类物质如4-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal，4-HNE）氧化为无毒性的相应酸，具有一定的抗氧化作用。研究发现ALDH2与心血管疾病密切相关，可以减轻心肌梗死、糖尿病以及饮酒等引起的心脏功能损伤、心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍等。目前我们课题组已经证实糖尿病大鼠体内ALDH2的活性明显下降，其机制可能与氧化应激有关。许多研究包括2012年最新的全基因组序列分析已经证实ALDH2是冠心病的易感基因。
　　基于以往的研究基础，我们推论:1、NLRP3炎症小体的激活在高脂诱导血管内皮功能障碍的过程中具有重要作用;2、ALDH2可以通过胰岛素信号通路改善高脂诱导的血管内皮功能障碍，其机制可能是通过对NLRP3炎症小体的调控。
　　目的：
　　本课题的研究目的是探讨:
　　1.NLRP3炎症小体在高脂诱导血管内皮功能障碍中的作用及机制。
　　2.ALDH2对高脂诱导的血管内皮功能障碍的影响以及可能的机制。
　　3.ALDH2对NLRP3炎症小体的调控及其机制。
　　方法：
　　1.细胞培养:本实验选用购自美国ATCC公司的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，培养基为含5％胎牛血清的ECM培养基。利用棕榈酸(Palmiticacid, PA)加脂多糖(LPS)刺激HUVECs诱导内皮功能障碍。
　　2.动物模型:7周龄左右雄性C57BL/6J小鼠40只（体重20g左右），随机分为4组，为对照+GFP病毒组、高脂+GFP病毒组、对照+ALDH2病毒组、高腊+ALDH2病毒组。对照组给予标准普通饲料饮食和高脂组给予含60％能量的高腊饮食(HFD)。10周后分别给予小鼠尾静脉注射GFP慢病毒和ALDH2过表达慢病毒。12周后处死，留取小鼠主动脉血管等组织标本进行检测。
　　3.慢病毒转染:各组HUVECs刺激前转染GFP和ALDH2过表达慢病毒，转染48小时后再给予LPS+PA刺激。
　　4.小干扰RNA转染:HUVECs刺激前分组转染人NLRP3、Caspase-1和ASC的小干扰RNA，干扰48小时后再给予LPS+PA刺激。
　　5.实时定量逆转录PCR(RT-PCR):收集各组HUVECs，提取RNA后进行RT-PCR，检测各组细胞中ALDH2 mRNA的表达水平。
　　6.ALDH2活性测定:提取细胞线粒体蛋白与ALDH2底物乙醛或丙醛反应，测定ALDH2的活性。
　　7.蛋白印迹法(Western blot，WB):各组刺激后收集HUVECs，提取蛋白，统一蛋白浓度。分别检测p-eNOS(Ser1177)、t-eNOS、p-Akt(Ser473)、t-Akt、p-AMPKα(Thr172)、 t-AMPKα、 NLRP3、 ASC、 Pro-Caspase-1、 cleavedCaspase-1(p10)、Pro-IL-1β、IL-1β、ALDH2和β-actin等蛋白的表达水平。
　　8.统计分析:数据表示为均数±标准差，使用SPSS软件进行统计分析。p＜0.05认为是有显著的统计学差异。
　　结果：
　　1.PA显著抑制IRS-1-Akt-eNOS信号通路的活性。
　　与正常对照组和LPS组相比，单独加不同浓度PA刺激可以降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达，但是总的Akt和eNOS表达没有改变;在不同浓度PA刺激前提前加入LPS预刺激，可以更加显著的降低Akt和eNOS的磷酸化表达。
　　2.NLRP3小体介导了PA对胰岛素信号通路活性的损伤。
　　WB结果显示:与正常对照组和LPS组相比，单独加不同浓度PA刺激没有改变NLRP3炎症小体、cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表达，而在不同浓度PA刺激前提前加入LPS预刺激，没有改变NLRP3炎症小体的表达，但是可以显著的增加cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表达。不同浓度的IL-1β刺激可以显著降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达，不改变Akt和eNOS总蛋白表达。利用siRNA抑制NLRP3炎症小体表达后，IL-1β蛋白的表达明显减少，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达有了明显的改善。
　　3.AMPKα负性调节PA对NLRP3炎症小体的激活。
　　与正常对照组和LPS组相比，单独加不同浓度PA刺激可以降低p-AMPKα(Thr172)的表达而不改变总的AMPKα的表达，而在不同浓度PA刺激前提前加入LPS预刺激，可以更加显著的降低p-AMPKα(Thr172)的表达。加入AMPK激活剂AICAR后，cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表达明显减少，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达有了明显的改善。
　　4.增加ALDH2的蛋白表达改善胰岛素信号通路的活性。
　　HUVECs转染ALDH2过表达慢病毒增加ALDH2蛋白表达后，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达可以得到明显改善。
　　5.增加ALDH2的蛋白表达可以通过激活AMPKα来抑制NLRP3炎症小体的激活。
　　WB结果显示:ALDH2过表达慢病毒可以使AMPKα磷酸化增加，cleavedCaspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表达明显减少
　　6.ALDH2可以明显改善小鼠主动脉内皮IRS-1-Akt-eNOS信号通路的活性。
　　小鼠体内实验显示:与普通饮食相比，单独ALDH2过表达没有影响Akt和eNOS的磷酸化，HFD可以明显降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达，但是与HFD组相比，ALDH2过表达可以明显恢复HFD引起的Akt和eNOS的磷酸化抑制。
　　7.在小鼠主动脉内皮，ALDH2可以激活AMPK、抑制NLRP3炎症小体的激活。
　　小鼠主动脉内皮的WB结果显示:各组NLRP3炎症小体的蛋白表达没有改变。与普通饮食相比，单独ALDH2过表达没有改变p-AMPKα(Thr172)、cleavedCaspase-1(p10)和IL-1β的表达，HFD可以明显抑制AMPKα的磷酸化、增加cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β的表达，但是与HFD组相比，HFD+ALDH2过表达可以明显增加p-AMPKα(Thr172)的表达、降低cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β的表达。
　　结论：
　　1.高脂通过激活NLRP3炎症小体损伤胰岛素信号通路，进而引起血管内皮功能障碍;
　　2.AMPKα介导了高脂对NLRP3炎症小体的激活;
　　3.ALDH2可以通过增加胰岛素信号通路的活性来改善高脂诱导的血管内皮功能障碍，其机制可能与增加AMPKα的活性进而抑制NLRP3炎症小体的激活有关。
　　论文Ⅱ
　　ULK1在一氧化氦(NO)调节SIRT1表达中的作用及其机制研究
　　背景：
　　SIRT1是依赖于NAD+的第三类组蛋白去乙酰化酶，主要分布于细胞核，细胞质内也有。它广泛存在于各种组织中，除组蛋白外，还作用于多种非组蛋白如p53、FOXO、eNOS、iNOS、NF-κB、PARP-1等，参与调控DNA修复、氧化应激、炎症、糖脂代谢、细胞衰老等多种生理病理过程，对代谢综合征、动脉粥样硬化、糖尿病和衰老等多种心血管疾病具有重要作用。健康的血管内皮功能依赖内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性和一氧化氮(NO)的产生。NO具有舒张血管活性，可以抑制动脉粥样斑块的聚集和促进血管新生。研究发现，eNOS生成NO需要SIRT1去乙酰化活性，SIRT1也可以保护炎症和凋亡诱导的血管内皮功能。
　　探讨SIRT1的调控机制非常重要，它可以为这些疾病提供新的治疗靶点。但是目前SIRT1蛋白调控的机制还不是很清楚。研究表明，eNOS可以正向调节SIRT1蛋白的表达。而且SIRT1可以被p38蛋白激酶介导的蛋白酶体所降解，引起细胞衰老。最近研究证实eNOS产生的NO是26s蛋白酶体功能的内源性抑制剂。
　　因此基于以上研究基础，我们推测: NO可以通过抑制26s蛋白酶体活性来增加SIRT1蛋白表达。
　　目的：
　　本课题的研究目的是探讨:NO对SIRT1蛋白表达的调控及其机制。
　　方法：
　　1.细胞培养:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人胚胎肾脏上皮细胞系(HEK293T与HEK293AD)和GFPu-1细胞购自美国ATCC公司(Manassas，VA);表达GFP-LC3B的U20S细胞购自EMD Millipore（Billerica，MA）;小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)来源于Ulk1-/-，Ulk2-/-，Ulk1-/-/2-/-和WT小鼠。HUVECs培养基为含5％FBS的EBM培养基;MEF、HEK293T、U20S和GFPu-1细胞的培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
　　2.动物实验:雄性eNOS敲除小鼠（10周龄）和db/db小鼠（25周龄）和相同周龄的C57BL/6JWT小鼠从Jackson lab购买。
　　3.腺病毒、质粒和小干扰RNA(siRNA)转染:
　　腺病毒转染:HUVECs和MEF细胞转染eNOS和GFP对照的腺病毒48小时。
　　质粒转染:HEK293T细胞转染UbG76V-GFP质粒48小时。
　　siRNA转染:HUVECs按照Santa Cruz公司提供的方法转染对照或者ULK1和β-TrCP1的siRNA48小时，
　　4.RT-PCR:使用总RNA提取试剂盒从HUVECs和HEK293T细胞提取总的RNA，然后用RT-PCR测定SIRT1和18s mRNA的水平。
　　5.26S蛋白酶体活性测定:使用含荧光的蛋白酶体底物AMC来测定糜蛋白酶样活性来作为26蛋白酶体的活性，是ATP依赖的清除活性，具体是在37℃，380/460 nm波长条件下，用荧光酶标仪测定游离AMC的水平。
　　6.糖基化修饰蛋白测定:用细胞裂解液提取细胞蛋白，用WGA方法测定糖基化修饰蛋白的表达水平。
　　7.蛋白印迹法(Western blot，WB):收集细胞后，提取蛋白，统一蛋白浓度，测定ULK1、OGT、eNOS、SIRT1、O-GlcNAc、LC3B，、Beclin-1、p62、β-TrCP1、GFP、Rpt2、β7和β-actin蛋白的表达水平。
　　8.统计分析:数据表示为均数±标准差，使用SPSS软件进行统计分析。p＜0.05认为是有显著的统计学差异。
　　结果：
　　1.在血管内皮细胞中，NO稳定和增加SIRT1的表达。
　　增加eNOS表达可以明显的增加SIRT1的表达，eNOS的激动剂A23187和直接的一氧化氮NONOate可以增加SIRT1的表达，且具有时间依赖性，但是没有改变SIRT1的mRNA表达水平。追逐实验表明:不同时间点，CHX可以降低SIRT1蛋白表达，NONOate可以显著的增加SIRT1的稳定性。另外，MG132作为一种26S蛋白酶体的抑制剂可以上调SIRT1的表达。
　　2.在血管内皮细胞中，NO稳定和增加ULK1的表达。
　　eNOS过表达可以明显的增加ULK1的表达，不同的时间条件下，A23187和NONOate也可以增加ULK1的表达;同样在追逐实验中，NONOate和A23187都可以显著的增加SIRT1的稳定性。
　　3.ULK1介导了NO对SIRT1的调控。
　　在WT和Ulk2-/-MEF细胞，eNOS过表达或者NONOate可以明显的增加SIRT1的表达，但是在Ulk1-/-和Ulk1-/-/2-/-MEF细胞中SIRT1的表达没有增加。在HUVECs中，与对照组相比，A23187和NONOate可以增加SIRT1蛋白的表达，用siRNA抑制ULK1表达以后，A23187和NONOate没有增加SIRT1蛋白的表达。在HEK293T细胞中转染ULK1质粒后，SIRT1蛋白的表达明显升高，但是mRNA水平没有改变。
　　4.NO或者ULK1对SIRT1的调控不依赖于自噬。
　　雷帕霉素可以激活LC3B和自噬小体，但是不能增加SIRT1的表达;NONOate对自噬小体的影响很小，而且NONOate、eNOS和A23187没有改变自噬相关蛋白（p62、Beclin-1和LC3B）的表达;在MEF细胞中，自噬的抑制剂BafA1没有恢复SIRT1的表达。
　　5.ULK1可以调控26S蛋白酶体的功能。
　　GFPu-1细胞（检测26S蛋白酶体活性的工具细胞）过表达ULK1后，GFP蛋白表达增加，GFP荧光增强，质粒转染HEK293T细胞后26S蛋白酶体活性降低;MEF细胞转染UbG76V-GFP（一种26S蛋白酶体的检测工具与GFPu-1相似）质粒后，GFP表达明显降低，Ulk1-/-MEF和siULK1转染HUVECs都可以增加26S蛋白酶体活性。
　　6.OGT介导了ULK1对26S蛋白酶体的调控。
　　ULK1过表达显著增加OGT蛋白表达和糖基化修饰水平。使用WGA富集糖基化修饰蛋白，发现ULK1过表达可以增加Rpt2的糖基化。相反，使用siRNA抑制ULK1表达可以降低OGT蛋白表达和糖基化修饰水平，而且加入NONOate刺激后OGT蛋白表达和糖基化修饰水平不再增加。
　　7.在eNOS敲除小鼠和db/db小鼠组织可以验证NO-ULK1-SIRT1通路。
　　eNOS敲除小鼠的肺脏组织中，ULK1和SIRT1蛋白表达明显下降;在2型糖尿病db/db小鼠的肺脏和心脏组织中，eNOS表达明显降低，相应的ULK1和SIRT1蛋白的表达水平也显著下降。
　　结论：
　　一氧化氮(NO)可以通过增加ULK1和OGT表达来抑制26S蛋白酶体活性，进而增加SIRT1的表达，其机制不依赖于自噬。

目录

声明

论文I 乙醛脱氢酶2对高脂诱导的血管内皮功能障碍的影响及其机制研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

2．结果

讨论

创新点与限制性

结论

附图

参考文献

论文Ⅱ ULK1在一氧化氮(NO)调节SIRT1表达中的作用及其机制研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

创新点和限制性

结论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文及获奖情况

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