线粒体动力学相关基因在阿尔茨海默病中的临床研究

摘要

背景:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统变性疾病，临床表现以渐进性记忆障碍、人格和行为改变为特征，是老年期痴呆的最常见病因。近年来AD的发病率逐年上升，全球因痴呆带来的经济负担也逐年增加。然而迄今为止，对于AD仍缺乏有效治疗方法。因此，如何早期发现诊断AD，探索防治AD的新方法显得尤为迫切。
　　近来有多种证据表明AD患者中存在着线粒体功能障碍。线粒体在细胞中行使着极其重要的生理功能，包括合成ATP、维持钙离子稳态、产生活性氧(reactiveoxygen species，ROS)和调控凋亡信号等，所以线粒体在细胞的存活和死亡尤其对于神经元等细胞具有至关重要的作用。氧化应激和线粒体功能异常已经在尸检的AD病人脑中，AD病人的血小板中，在AD转基因小鼠，APP转基因细胞系中，经过Aβ处理后的哺乳动物细胞和AD转基因小鼠的初级神经元细胞中都有过研究报道。AD患者线粒体功能障碍体现在多种方面，如线粒体基因缺陷、酶活性降低、异常基因的表达等。然而，越来越多的研究表明，AD患者线粒体动力学异常在其中有重要作用，线粒体动力学包括线粒体分裂和融合。Aβ处理后的神经元中，AD转基因细胞系中，线粒体分裂基因(Drp1和Fis1)表达增加，线粒体融合基因(Mfn1，Mfn2，and Opa1)表达减少。AD患者和APP转基因小鼠脑内同样可以观察到上述分子的改变。有学者对AD患者前额叶的神经元中Drp1mRNA水平进行检测。但在AD患者的血液中线粒体动力学相关分子的mRNA水平至今没有相关研究报道。
　　目前已经发现了一些可靠的生物学标志物辅助AD的诊断，如脑脊液中β-淀粉样蛋白水平下降和tau蛋白浓度的上升，MRI测定的心室容积和全脑容量改变。有些生物学分子在AD的诊断中也起了一定的作用，如炎性因子CD40、miR-146b、miR-181a等，但由于表达不稳定、仅在体外研究等原因，仍不能作为AD诊断的生物学标志物。
　　因此，本研究从临床收集AD患者及对照组的新鲜血液，通过提取mRNA，测定线粒体动力学相关基因在病例组和对照组中表达有无差异，并为其成为AD早期诊断的生物学标志物和治疗靶点提供依据。
　　目的:
　　比较AD患者与对照组血液中线粒体动力学相关分子Drp1和Opa1的mRNA水平。
　　方法:
　　1.收集AD患者及对照组血液标本;
　　2.RT-PCR检测线粒体动力学相关分子Drp1和Opa1的mRNA水平。
　　结果:
　　1.收集AD患者血液标本共27例，均为2014.6-2014.11在山东大学第二医院临床轮转期间神经内科门诊和住院病人。所有患者的入选标准均根据1984年美国国家神经病及语言障碍和卒中研究所NINCDS-阿尔茨海默病及相关疾病学会ADRD制定的诊断标准2011年修订版。其中男性11例，女性16例，平均年龄73.33岁。所有患者均进行简易精神状况检查量表MMSE、临床痴呆评定量表CDR检测，并根据MMSE评分进行简易痴呆严重程度分级，27例临床患者中轻度0例，中度10例，重度17例。
　　2.对照组:共27例，均为在山东大学第二医院健康查体中心行健康查体的老年人。其中男性11例，女性16例，平均年龄69.07岁。性别与AD病例组完全匹配，两组之间年龄无统计学差异。对照组入组标准:1）无谵妄或其他精神系统疾病;2）MMSE≥27分;3）近期无外伤、手术、颅内感染、脏器出血等疾病史;4）无冠心病、严重高血压、高血脂、糖尿病、癫痫、中毒、肝肾功能异常、恶性肿瘤等病史;5）对该项研究均知情同意;
　　3.RT-PCR结果:采集所有研究对象的清晨空腹血3-5ml，EDTA抗凝，采用RT-PCR检测，RQ=2-ΔΔCT法计算，IBM SPSS22.0进行统计学分析。其中病例组与对照组间比较采用独立样本t检验，组内各因素如年龄、性别所致差异用单因素方差分析方法，p＜0.05有统计学差异。
　　1)两组研究对象的年龄、性别构成无统计学差异。
　　2)病例组外周血Drp1和Opa1基因的mRNA水平较对照组均有升高，Drp1基因升高更明显。
　　3)病例组内Drp1基因mRNA水平存在性别差异，女性约为男性2倍;分别与对照组男性和女性相比，病例组内该基因水平均升高，女性升高更明显。
　　4)病例组和对照组内Opa1表达水平均存在性别差异，女性高于男性;分别与对照组男性和女性相比，病例组内该基因水平均升高。
　　5)病例组内不同年龄阶段Drp1和Opa1基因的mRNA水平无明显差异。
　　6)病例组内中度和重度患者两基因表达水平无明显差异。
　　结论:
　　1.AD患者较对照组血液中线粒体分裂基因Drp1的mRNA水平明显增加，与以前报道的脑组织和细胞模型的研究结果一致;线粒体融合基因Opa1的mRNA水平也有所增加。
　　2.小样本散发阿尔茨海默病患者的血标本中存在Drp1基因水平增高，可为AD早期诊断的生物学标志物提供新的研究方向和依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

研究对象与材料

研究对象

主要实验仪器

主要试剂耗材

实验方法

1．病史采集

2．外周血采集

3．Trizol法提取总RNA

4．mRNA逆转录为cDNA

5．实时荧光定量PCR反应

6．实验结果的可靠性和结果分析方法

实验结果

1．两组研究对象在年龄、性别构成无统计学差异

2．病例组外周血Drp1、Opa1基因mRNA水平较对照组均有升高，Drp1基因升高趋势更明显

3．病例组内Drp1基因mRNA水平存在性别差异，女性约为男性2倍；分别与对照组男性和女性相比，病例组内该基因水平均升高，女性升高趋势更明显

4．病例组和对照组内Opa1表达水平均存在性别差异，女性高于男性；分别与对照组男性和女性相比，病例组内该基因水平均升高

5．病例组内不同年龄阶段Drp1、Opa1mRNA水平无明显差异

6．病例组内中度和重度患者两基因表达水平无明显差异

讨论

结论

附图

参考文献

致谢