冠心病合并高血压1号染色体高密度扫描易感基因关联分析

摘要

目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease，CAD)是一种由环境和遗传因素共同作用引起的复杂性多基因遗传疾病，严重威胁着人类的健康，针对冠心病易感基因的研究一直备受重视。原发性高血压(essential hypertension，EH)作为冠心病的重要病因之一，也是一种多基因遗传疾病，通过损伤血管内皮引发炎症反应导致冠状动脉粥样硬化的形成。提示两者之间可能存在共同的易感基因和发病机制。但是由于两种疾病均具有复杂遗传疾病的特点，如未知、复杂的遗传模式，遗传异质性，及表型异质性等，迄今为止，对高血压诱发冠心病机制的研究，大多集中在蛋白质-核酸水平，两者之间的分子遗传学机制仍不十分清楚。本研究将DNA混合池(DNA pooling)方法与芯片技术相结合，通过高密度筛查及关联分析发现冠心病及高血压的易感基因并探求两者之间的联系。
　　方法:
　　1.选取在山东大学齐鲁医院心内科住院并经冠状动脉造影确诊的冠心病合并高血压患者作为病例组，共115例;山东省血液中心的健康献血者作为对照组，共1，000例;此外，冠心病合并高血压重复验证组，共115例;原发性高血压验证组，共450例;冠心病合并高血压合并糖尿病合并血脂异常验证组，共146例;冠心病综合验证组，共607例。研究对象均已进行知情告知，且个体之间无血缘关系。
　　2.采集外周静脉血5ml，经EDTA抗凝，使用Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒，及Lab-Aid820核酸自动提取仪，用磁珠法提取全血DNA。用NANODROP2000超微量核酸蛋白测定仪（Thermo scientific，美国）检测DNA样本浓度。用三蒸水将所有DNA样品稀释至终浓度10ng/μl，每份浓度为10ng/μl的DNA溶液中取10μl进行混合，最终浓度仍为10ng/μl。建立两组DNA混合池样本，分别为115例冠心病合并高血压患者组和1，000例正常人对照组。
　　3.经过DNA酶切、连接及扩增，PCR产物纯化和定量，PCR产物片段化及PCR产物标记和杂交，然后用Array Holding Buffer对人类SNP6.0芯片（Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array6.0）进行清洗，最后在Affymetrix7G芯片扫描仪（AFFX，美国）中进行样本扫描。
　　4.统计分析，应用Genotyping Console软件对扫描后数据进行基因分型，得到全基因组等位基因图谱，比较病例组与对照组的各SNP位点的等位基因频率并进行卡方检验。最终得到有差异的SNP位点等位基因型，初步的拷贝数(copy number，CN)和关联分析(association analysis)结果。
　　结果:
　　本次研究，共得到1号染色体上71，480个SNP位点的基因分型数据，其中5个SNP位点与冠心病合并高血压高度相关(p≤6.96×10-8)，分别为rs12120090(lp31.1)、rs2788417(lp13.2)、rs17347980(lq32.1)、rs17018933(lq32.3)和rs1218660(lq43)。在对该结果的验证实验中同样发现这5个位点与冠心病合并高血压密切相关。并且发现这5个位点不仅与冠心病合并高血压相关，也与糖尿病等危险因素关系密切。此外，这5个位点附近相应的基因分别为ELTD1、CTTNBP2NL、NUCKS1、PPP2R5A和CHRM3，在中国汉族人群中与冠心病的关联报道尚属首次。
　　结论:
　　中国汉族冠心病人群中，rs12120090(lp31.1)、rs2788417(lp13.2)、rs17347980(lq32.1)、rs17018933(lq32.3)和rs1218660(lq43)位点与冠心病合并高血压病显著相关(p≤6.96×10-8)，提示其附近的基因可能与冠心病及高血压易感性有关。今后，将进一步精细定位冠心病的易感基因。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

资料与方法

1．研究对象

2．实验试剂

3．实验仪器

4．实验步骤

结果

1．病例-对照组的关联分析

2．验证组的关联分析

讨论

1．易感基因研究策略

2．与冠心病合并高血压相关的1号染色体位点

3．相应位点的关联基因

4．创新性与限制性

结论

附录

参考文献

综述 冠心病易感基因的研究进展

致谢

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