5,6-二羟基-3,7,4’-三甲氧基黄酮醇化合物的抗肝癌活性及机制研究

摘要

目前恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康的因素之一，其中肝癌的发病率及致死率更是呈现逐年上升的趋势。癌症的发病机制复杂，其预防与治疗一直备受关注，而在临床上肿瘤耐药更是化疗失败的罪魁祸首，寻找新型抗癌药物是新药研发的热点。天然产物一直是癌症治疗先导化合物的重要来源。本课题研究的对象----化合物5，6-二羟基-3，7，4'-三甲氧基黄酮醇(AH5表示)就是从传统中药须弥紫菀中提取得到的一种黄酮类化合物。在本论文中，我们从抗肿瘤活性及细胞内分子机制两方面对AH5进行系统研究。
　　本文首先MTT法检测细胞毒性实验表明该化合物对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用，尤其对肝癌细胞作用最明显，而对正常细胞毒性很小，对肿瘤细胞的抑制具有时间和剂量依赖性。不同浓度AH5作用细胞12 h，显微镜下观察到细胞变圆，用流式细胞仪检测到实验组细胞有明显的G2/M周期阻滞现象。继续作用24小时，显微镜下观察到细胞皱缩，核裂解，细胞膜出现小泡状包裹细胞碎片，用凋亡试剂盒检测细胞呈现明显的凋亡状态。DAPI染色进一步验证了凋亡小体的形成。Western blot蛋白免疫印迹法检测了经AH5处理的HepG2细胞中周期相关蛋白及caspases凋亡蛋白的表达变化。AH5降低cyclin B1的表达，上调p-cdc2蛋白水平，表明AH5能够降低复合物cyclin B/cdc2的活性，使细胞阻滞在G2/M期。AH5作用的细胞中caspases-3，9的活化形式增加，这也标志着细胞凋亡的发生。以上结果表明，AH5具有诱导细胞G2/M阻滞和凋亡的抗肿瘤活性。进一步研究AH5对HepG2细胞作用的分子机制。前面的实验结果发现AH5对HepG2（p53野生型）的作用敏感于其他肝癌细胞。Western blot和RT-PCR法检测到p53及其调控细胞周期的下游靶基因p21在蛋白和基因表达水平都明显升高。而PFT-α（p53转录特异性抑制剂）对AH5诱导的周期阻滞有明显抑制作用。RT-PCR结果表明，p53及下游基因Bax的表达也增加。我们的实验还发现AH5诱导的凋亡机制与线粒体介导的途径有关。结果显示AH5处理细胞会出现明显的线粒体膜电势降低和细胞色素C释放，激活caspases级联反应，诱导凋亡。有文献报道，细胞的应激作用能诱导p53在细胞质中的累积，直接导致Bax寡聚化，进而诱发线粒体途径的凋亡。免疫荧光染色和蛋白质印迹分析亚细胞成分的实验证实了p53转录非依赖线粒体途径参与了AH5诱导的凋亡。抑制剂PFT-α和PFT-μ部分逆转了AH5诱导的细胞存活率下降，线粒体膜电势降低及凋亡作用，证实p53转录依赖和非依赖途径都包括在AH5诱导的凋亡机制中。综上结果表明，AH5具有明显的抗肿瘤活性。通过激活p53调控下游p21的表达，诱导HepG2细胞阻滞在G2/M期。AH5激活HepG2细胞中p53信号通路，通过转录依赖和非依赖途径调节Bax的表达和聚集形式，诱发线粒体途径凋亡。AH5作为一种潜在的抗肿瘤新药值得更进一步的深入研究。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

1 绪论

2 AH5抗肝癌活性的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 细胞株

2．2．2 化合物

2．2．3 试剂

2．2．4 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 MTT法测AH5细胞毒性

2．3．3 细胞周期分布检测

2．3．4 DAPI染色

2．3．5 Annexin V-PI双染检测细胞凋亡

2．3．6 Western blot蛋白含量分析

2．4 实验结果

2．4．1 AH5抑制肝癌细胞增殖

2．4．2 AH5诱导肝癌细胞周期阻滞

2．4．3 AH5影响调控G2／M期的相关蛋白表达

2．4．4 AH5诱导肝癌细胞凋亡

2．4．5 AH5活化caspase-3，caspase-9凋亡蛋白的表达

2．5 结论及讨论

3 AH5诱导HepG2细胞G2／M期阻滞和凋亡的机制研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 细胞株

3．2．2 化合物

3．2．3 试剂

3．2．4 仪器

3．3 实验方法

3．3．1 MTT法细胞存活率测定

3．3．2 流式细胞术测细胞周期分布

3．3．3 凋亡试剂盒检测细胞凋亡

3．3．4 JC-1测线粒体膜电势

3．3．5 免疫荧光染色

3．3．6 RNA提取和实时定量PCR

3．3．7 亚细胞蛋白分离提取

3．3．8 Western blot蛋白含量测定

3．4 实验结果

3．4．1 AH5影响HepG2细胞p53，p21 mRNA及蛋白的表达

3．4．2 PFT-α抑制AH5诱导的G2／M期阻滞

3．4．3 AH5上调HepG2细胞p53，Bax mRNA及蛋白的表达

3．4．4 AH5诱导线粒体膜电势降低，细胞色素c释放

3．4．5 AH5诱导线粒体中p53累积和Bax移位

3．4．6 抑制剂PFT-α和PFT-μ对AH5促凋亡活性的影响

3．5 结论及讨论

参考文献

致谢