一种新型水蛭纤溶酶的活性和机制研究

摘要

血栓性疾病是威胁人类健康的重大疾病。溶栓治疗是血栓性疾病的主要治疗手段，临床上常使用的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)及其变异体在使用过程中存在诸多不良反应。因此，近期人们致力于从多种天然材料中得到新型的可用于溶栓治疗的物质。中药的应用亦得到重视，如水蛭。水蛭是一味传统中药，《神农本草经》记载其有“逐恶血、淤血”“破血瘕积聚”的功效。现代中医使用单味水蛭或复方，用其煎剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液等多种剂型，通过内服外敷和局部注射等多种途径给药广泛治疗不同系统、病位的血瘀症。自20世纪50年代水蛭素被发现以来，国内外的科学工作者已经从不同品种的水蛭中提取得到多种可用于治疗血栓性疾病的蛋白质或多肽，如凝血酶抑制剂、凝血因子抑制剂、血小板糖蛋白抑制剂、胶原蛋白介导的血小板聚集抑制剂和抗血栓蛋白等。本论文以中药水蛭宽体金线蛭的干燥全体为试验材料，以实验室前期工作发现的新型水蛭纤溶酶为研究对象，对新型水蛭纤溶酶的溶栓活性、酶学性质、作用机理进行初步研究，为开发水蛭纤溶酶为新型溶栓药物奠定理论基础。论文主要内容如下。
　　1.水蛭纤溶酶的分离纯化:试验采用酶解法、醇沉法对水蛭干品进行处理得到蛋白粗提物，粗提物经Q Sephrose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析纯化得到水蛭纤溶酶。并对提取时采用的酶解法的合理性进行验证。
　　2.水蛭纤溶酶的活性测定及水蛭纤溶酶的酶学性质测定:试验采用偶氮酪蛋白法对水蛭纤溶酶的酶活力进行检测，经检测，水蛭纤溶酶有纤溶活性，水蛭纤溶酶的酶活为400U/mg。试验还对水蛭纤溶酶的最适温度和pH值;温度稳定性和pH值稳定性以及金属离子对酶活力的影响进行测定。经检测，水蛭纤溶酶的最适温度为55℃，当温度超过60℃时酶活力损失较大;最适pH为8.5，当pH超过9时酶活力损失较大;200mM Na+，400mM Zn2+，200mM Mg2+和200mM K+对水蛭纤溶酶的酶活力有促进作用，而200mM Mn2+，400mM Ca2+和200mM Zn2+有抑制水蛭纤溶酶酶活力的作用;水蛭纤溶酶在碱性环境中稳定性较高，该酶在pH7-pH9之间保持1h后，可保留50％以上的酶活力，在80℃保温1h仍可保留50％的酶活力;
　　3.水蛭纤溶酶的体外溶栓活性测定:大鼠断头取血，在试管中形成血块，检测水蛭纤溶酶对血块的降解情况。试验表明，水蛭纤溶酶具有较高的溶栓活性，对形成时间在12h内的血栓都有降解作用且其溶栓活性与酶浓度相关。
　　4.水蛭纤溶酶作用机制的初步探究:本课题检测了水蛭纤溶酶对纤维蛋白和纤维蛋白原的降解作用，结果表明:水蛭纤溶酶对纤维蛋白的降解作用十分迅速，30min内就发生了明显的降解作用，首先降解纤维蛋白的γ-γ和α链，随后降解β链，30min后，三者的降解情况没有明显变化;水蛭纤溶酶在30min内对纤维蛋白原也有明显的降解作用，首先降解其Aα链，随后降解Bβ链和γ链，且Bβ链和γ链的降解在30min后表现出了一定的时间依赖性，而Aα链的降解情况并没有明显变化。

目录

声明

摘要

缩略词语汇表

第一章 绪论

1．血栓性疾病

2．溶栓药物发展的历史和现状

2．1．链激酶

2．2．组织型纤溶酶原激活剂t-PA

2．3．基因工程技术改造的t-PA变体

2．4．天然来源的纤溶酶原激活物

2．5．直接作用于纤维蛋白的溶栓物质

3．溶栓药物的发展前景

4．中药水蛭的应用

4．1．中药水蛭简介

4．2．水蛭治疗血栓性疾病的药理活性成分

4．3．水蛭的其他药理活性

5．课题研究的内容及意义

第二章 水蛭纤溶酶的制备

1．实验材料

1．1．实验仪器

1．2．实验试剂及材料

1．3．实验主要溶液及试剂配方

2．实验方法

2．1．水蛭纤溶酶的分离纯化

2．2．酶解法合理性和必要性的验证

3．实验结果

3．1．水蛭纤溶酶的分离纯化

3．2．酶解法的验证

4．讨论

5．本章小结

第三章 水蛭纤溶酶酶学性质的测定

1．实验材料

1．1．实验仪器

1．2．实验试剂

1．3．实验试剂及溶液配方

2．实验方法

2．1．水蛭纤溶酶酶活力的测定

2．2．水蛭纤溶酶酶学性质的测定

3．实验结果

3．1．水蛭纤溶酶的酶活力测定

3．2．水蛭纤溶酶的酶学性质的测定

4．讨论

5．本章小结

第四章 水蛭纤溶酶的体外溶栓活性测定

1．实验材料

1．1．实验仪器

1．2．实验材料和试剂

1．3．实验主要溶液及试剂的配制

2．实验方法

2．1．不同浓度的水蛭纤溶酶溶栓活性的测定

2．2．水蛭纤溶酶对形成时间不同的血栓的降解作用

3．实验结果

3．1．不同浓度的水蛭纤溶酶的体外溶栓活性

3．2．水蛭纤溶酶对形成时间大于6h的血栓的降解情况

4．讨论

5．本章小结

第五章 水蛭纤溶酶作用机制的研究

1．实验材料

1．1．实验仪器

1．2．实验试剂

1．3．实验主要溶液及试剂配方

2．实验方法

2．1．水蛭纤溶酶对纤维蛋白的降解测定

2．2．水蛭纤溶酶对纤维蛋白原的降解分析

3．实验结果

3．1．水蛭纤溶酶对纤维蛋白的降解分析

3．2．水蛭纤溶酶对纤维蛋白原的降解分析

4．讨论

5．本章小结

第六章 论文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文