腺相关病毒介导β-NGF基因转染大鼠内皮祖细胞及其对增殖的影响

摘要

随着工业化程度的提高，我国脊髓损伤发病率呈逐年上升趋势，每年有数以万计的人因脊髓损伤致残。但脊髓损伤的治疗至今缺少有效措施，损伤后神经修复一直是未能解决难题。目前基因治疗已成为治疗疾病的新趋势，为许多难治性疾病的治疗带来了新思路，选择合适的细胞、基因及载体是基因治疗的关键。
　　本实验将促进新生血管形成的内皮祖细胞、促进受损神经再生修复的神经生长因子和安全可靠的腺相关病毒载体三者结合，完成了腺相关病毒介导β神经生长因子基因转染内皮祖细胞，证实转染β神经生长因子基因的内皮祖细胞可持续表达β神经生长因子，且转染后内皮祖细胞的增殖活性增强。为下一步利用携带β-NGF基因的内皮祖细胞促进脊髓损伤的修复提供了实验基础。
　　目的:
　　利用重组腺相关病毒载体介导β-NGF基因转染大鼠骨髓源内皮祖细胞，观察目的基因β-NGF的表达情况及对内皮祖细胞增殖的影响，探讨携带β-NGF基因的骨髓源性内皮祖细胞应用于基因-干细胞移植治疗的可行性。
　　方法:
　　使用密度梯度离心法从大鼠骨髓分离单个核细胞，利用专用培养液EGM-2MV诱导培养出大鼠骨髓源内皮祖细胞，免疫荧光检测技术检测细胞表面标记分子(VEGFR2、CD133、CD34)以鉴定内皮祖细胞。使用构建的携带β-NGF基因的重组腺相关病毒(rAAV-GFP-β-NGF)转染内皮祖细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，计算转染效率。利用ELISA法在蛋白水平检测β-NGF的表达情况。MTT法检测目的基因对内皮祖细胞增殖活性的影响。
　　结果:
　　成功从大鼠骨髓中分离培养出内皮祖细胞，免疫荧光检测显示特异性表面抗原CD34、CD133和VEGFR2呈阳性染色反应，鉴定符合内皮祖细胞特征。β-NGF基因成功转染内皮祖细胞，荧光显微镜下可见绿色荧光表达，转染率为65.30％。rAAV-GFP-β-NGF转染组细胞培养上清中检测到β-NGF的表达，且可持续10d。而空白组正常内皮细胞和空载病毒转染组内皮祖细胞未检测到β-NGF的表达。MTT检测显示，rAAV-GFP-β-NGF转染后内皮祖细胞增殖活性增高，与空载病毒转染组和空白对照组相比均有统计学意义(P＜0.05).空白组和空载病毒转染组之间增殖活性区别无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　经重组腺相关病毒介导可成功将β-NGF基因转染进大鼠骨髓源内皮祖细胞，使其持续表达β-NGF蛋白并促进内皮祖细胞增殖。为下一步利用携带β-NGF基因的骨髓源内皮祖细胞应用于基因-干细胞移植促进脊髓损伤的修复提供理论实验基础。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1 实验材料

2、实验方法

实验结果

3．1 大鼠骨髓源内皮祖细胞的培养

3．2 细胞表面标记物的免疫荧光检测

3．3 重组腺相关病毒对大鼠骨髓源内皮祖细胞感染效率的检测

3．4 腺相关病毒载体介导β-NGF基因在大鼠骨髓源内皮祖细胞中的表达

3．5 β-NGF基因转染后对内皮祖细胞增殖的影响

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文