二硫化碳染毒对大鼠神经组织中Keap1-Nrf2信号通路的影响

摘要

研究目的：
　　二硫化碳(carbon disulfide，CS2)是一种工业有机溶剂，被广泛用于粘胶纤维、玻璃纸、四氯化碳等的生产。CS2职业暴露可导致工人神经系统的损害，主要表现为周围神经病，但是其致病的机制仍尚未明确阐明。CS2中毒可使机体发生氧化应激，而越来越多的动物实验和人类研究证据表明氧化应激与多种神经退行性疾病如帕金森病等的发病机制密切相关，因此推测氧化应激可能与CS2致病机制有关。又Keap1-Nrf2信号通路是细胞抵抗氧化应激或亲电物质应激的主要机制，本研究欲通过CS2灌胃染毒建立大鼠亚慢性神经毒性模型，利用Western blot测定Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白表达量的改变，检验CS2是否能够引起该信号通路的变化，探讨其在CS2发病机制中的可能作用，为以后的机制研究提供理论依据。
　　研究方法：
　　成年雄性健康Wistar大鼠60只，体重300～330g，适应性喂养1周后，随机分为对照组、200、400和600mg/kg CS2染毒组，每组15只。将CS2溶于玉米油，2ml/kg灌胃染毒，每周染毒6次，持续6周，对照组给予等体积的玉米油。每天观察大鼠一般状态变化，尤其注意有无震颤，并于每周第3天和第7天称量体重并记录，第7天进行步态评分并记录。实验结束后处死大鼠取神经组织，利用Western blot检测脊髓和坐骨神经中Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白的相对含量。
　　研究结果：
　　1.CS2染毒对大鼠体重的影响:在整个实验周期内，对照组大鼠体重表现出稳步增长趋势，实验结束时较初始体重增加了28.69％;与对照组相比，200、400和600mg/kg剂量组体重增长缓慢，分别于第4周、第2周和第1周开始与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.CS2染毒对大鼠步态的影响:从实验开始至结束，200mg/kg组步态均未见明显异常改变，评分为1分。400mg/kg组于第4周开始出现异常步态改变，至实验结束时有1/2大鼠评分为3分，表现为共济失调明显、腹部着地走或滑行、跌倒等。600mg/kg组染毒第3周即表现出异常步态改变，到实验结束时，平均步态评分为3.33分，约1/3大鼠评分达到4分，表现为大鼠瘫痪，足后翻，不能支撑自身体重，行走困难。
　　3.CS2染毒对大鼠脊髓中Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响:CS2染毒后，脊髓胞核中Nrf2表达量显著升高，与对照组相比，400和600mg/kg组分别升高59.26％和93.30％，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而胞浆中Nrf2表达量呈下降趋势，600mg/kg组较对照组减少18.11％(P＜0.05);Keap1表达量在400和600mg/kg组分别降低了28.76％和40.52％，差异均有统计学意义（P＜0.05）;NQO1表达量呈增长趋势，但仅在600mg/kg剂量下有明显改变（P＜0.05）;p62表达量在三个染毒剂量下均未见明显变化(P＞0.05)，与之相比，p-p62表达量则表现出增加的趋势，各染毒组分别增加了21.52％、31.82％和34.20％，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.CS2染毒对大鼠脊髓中mTORC1复合物和Calcineurin蛋白表达的影响:给予CS2处理后，与对照组相比，三个染毒组中mTOR表达量分别升高了18.93％、23.42％和32.82％，raptor表达量在400和600mg/kg剂量下分别升高了23.83％和27.95％，差异均有统计学意义(P＜0.05); Calcineurin表达量未见明显改变(P＞0.05)。
　　5.CS2染毒对大鼠坐骨神经中Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响:CS2染毒后，与对照组相比，坐骨神经总蛋白中Nrf2表达量显著增加，在三个染毒组中分别增加了60.15％、74.54％和76.46％，差异均有统计学意义（P＜0.05）;Keap1表达量仅在600mg/kg剂量下改变明显，较对照组减少30.22％(P＜0.05);NQO1表达量亦显著增加，各染毒剂量下分别增加了79.52％、144.58％和119.28％，差异均有统计学意义（P＜0.05）;p62表达量在200、400和600mg/kg剂量下分别增加了34.26％、71.32％和75.89％，p-p62表达量在三个染毒组分别增加了91.53％、169.25％和174.12％，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.CS2染毒对大鼠坐骨神经中mTORC1复合物和Calcineurin蛋白表达的影响:CS2染毒后，坐骨神经中mTOR表达量变化不明显(P＞0.05)，而raptor表达量在三个染毒组均显著增加，较对照组分别增加了182.45％、214.89％和217.02％，差异均有统计学意义（P＜0.05）;Calcineurin表达量亦显著增加，三个剂量下分别增加了57.50％、83.79％和85.92％(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.CS2染毒可以激活Keap1-Nrf2信号通路，但是Nrf2的持续活化对机体是有益还是有害仍需进一步探讨。
　　2.CS2可能以p62依赖的方式激活Keap1-Nrf2信号通路。
　　3.p62的磷酸化可能与mTORC1复合物和Calcineurin有关。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．二硫化碳(carbon disulfide，CS2)基本情况及其神经毒性作用机制研究概述

2．Keap1-Nrf2信号通路概述

材料与方法

1．材料

2．实验方法

结果

1．CS2染毒大鼠一般情况

2．CS2染毒对大鼠神经组织中Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响

3．CS2染毒对神经组织中mTORC1复合物和钙调神经磷酸酶Calcineurin蛋白表达的影响

讨论

1．CS2染毒对大鼠一般情况的影响

2．CS2染毒对大鼠神经组织中Keap1-Nrf2信号通路的影响

3．p62磷酸化的影响因素的初步探讨

结论

参考文献

致谢

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